Vectores de Clonación y PCR: Características y Aplicaciones en Biología Molecular

Plásmidos

Los plásmidos son moléculas circulares de ADN extracromosómico que se autorreplican. Se encuentran en bacterias y levaduras. Algunos codifican resistencia a antibióticos, a metales, producen toxinas, entre otros. Reciben en promedio insertos de 5 kb.

Condiciones de un Vector

• Tamaño pequeño, alrededor de 3 kb.
• Carecer del gen mob.
• Expresar marcadores fenotípicos o de selección.
• Secuencias de ADN que pueden ser sustituidas por ADN exógeno.
• Llevar sitios de policlonaje (polilinker).

Tipos de Plásmidos

• Plásmidos Conjugativos: Pueden transferirse de una célula a otra.
  • Ejemplo: Plásmidos F como K-12.
• Plásmidos parecidos a F: Poseen resistencia a fármacos.
  • Ejemplo: R 100.
• Plásmidos Vectores: Poseen sitios simples de corte por Enzimas de Restricción (ER).
  • Utilizados para un amplio rango de huéspedes.
  • Ejemplo: pBR 322.
• Plásmidos Replicativos: Plásmidos naturales.
  • Baja capacidad de clonamiento.
  • Ejemplo: pRK 290.
• Plásmidos Movilizables: Se trasladan utilizando el aparato conjugativo de otros plásmidos.
• Plásmidos Conjugativos ayudadores: Ayudan a otros plásmidos.
  • Ejemplos: RP1, RP2, RP4.

Bacteriófagos

Entre ellos el fago Lambda (λ):

• ADN de doble cadena, lineal.
• Tamaño de 48.5 kb.
• Recibe tamaños de insertos de 18 a 25 kb.
• Poseen sitios de reconocimiento donde se inserta el ADN exógeno.
• El empaquetamiento se realiza in vitro.
• Fago λ + ADN foráneo.

Bacteriófago M13:

• Su replicación no produce lisis a la bacteria.
• Inconveniente: solo permiten la secuenciación en una única dirección.

Cosmidos

• Plásmido + secuencia cos del Fago λ = COSMIDO.
• Tamaño de 5 kb.
• Creados para clonar fragmentos largos de ADN.
• Recibe tamaño de insertos entre 40 y 45 kb.

Vectores de Última Generación

Llevan insertos grandes de ADN de un organismo (> 50 kb). Entre ellos:

• Cromosomas artificiales de levaduras (YAC) (llevan insertos de ≥ 200 kb).
• Cromosomas artificiales de bacterias (BAC), (≥ 300 kb).
• Cromosomas artificiales de P1 (PACs), (≥ 350 kb).
• Pueden producir deleciones en el ADN exógeno.

Endonucleasas de Restricción (ER)

• Llamadas endodesoxiribonucleasas.
• Reconocen y cortan secuencias específicas en el ADN (4 a 8 pb).
• Se encuentran en eubacterias y arqueobacterias.
• Se nombran de acuerdo con la especie de donde provienen y un número romano para distinguir enzimas diferentes.

Clasificación de las Endonucleasas de Restricción

• Clase I:
  • No cortan en los sitios de reconocimiento, sino a una distancia de varios nucleótidos.
  • Expresadas por tres genes.
  • Funciones: cortar el ADN y modificar el ADN.
  • Requieren de iones de Mg, ATP y SAM.
• Clase II:
  • Reconocen y rompen el ADN en secuencias específicas.
  • Expresados por dos genes diferentes como dos enzimas separadas.
  • ER clase II:
    • Cortan ambas tiras del ADN.
    • Requieren de iones de Mg.
  • Metiltransferasa clase II: produce modificación del ADN en forma independiente.
• Clase III:
  • Expresados por dos genes y sus funciones son semejantes a la clase I.

Actividad de las ER de la Clase II

• Unidad de enzima: Cantidad de enzima que digiere 1 µg de ADN en 1 hora a 37 ºC.
• Parámetros de reacción: Temperatura (el óptimo corresponde a la temperatura del organismo), pH y fuerza iónica.

Especificidad de las ER de la Clase II

• Reconocimiento de la secuencia.
• Posición del sitio de corte.
• Influencia de la metilación.

PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa)

Componentes de la PCR

• ADN polimerasa termoestable.
• Oligonucleótidos iniciadores (“primers”).
• Desoxiribonucleótidos trifosfatados (dNTPs).
• Cationes divalentes (Mg⁺⁺).
• Buffer (para mantener el pH).
• ADN molde (Templado).

Ciclo de la PCR

• Desnaturalización: 94 - 95 °C por 45 segundos si G+C < 55%.
• Hibridación (Annealing): calculada para cada par de primers.
  • Demasiado alta = poco o nada de producto.
  • Demasiado baja = annealing no específico = productos incorrectos.
• Extensión: a temperatura óptima de la ADN polimerasa utilizada. Ejemplo: 72 °C para Taq (Taq: 2000 pb/min).
• A partir del tercer ciclo se produce ADN de longitud deseada (producto principal).
• Número de ciclos:
  • >25 ciclos para amplificar un gen de copia única a partir de ADN genómico.
  • Algunos componentes son limitantes > 30 ciclos (si inicio = 10⁵ moléculas).

Variantes de la PCR

• Colony PCR: uso de colonias como fuente de ADN.
• Multiplex PCR: uso de varios partidores.
• Nested PCR: PCR en 2 etapas.
• RT- PCR: obtención de ADNc.

Polimerasas Termoestables

• Sintetizan ADN dependiente del ADN templado.
• Estabilidad:
  • Taq: 9 min a 97 °C.
  • Pwo: >2 hr a 100 °C.
• Fidelidad:
  • Taq: baja.
  • Pfu: alta.
• Actividad transferasa terminal: en el extremo 3´, ej. Taq agrega una A al extremo 3´, si en el extremo hay una C.
• Pwo y Tli generan extremos romos.
• Cantidad usada = 5 x 10¹² moléculas (1.5 unidades).
• La más común = Taq ADN polimerasa.
• Ejemplos:
  • Taq: Thermus aquaticus.
  • Pwo: Pyrococcus woesei.
  • Pfu: Pyrococcus furiosus.
  • Tli: Thermococcus littoralis.

Oligonucleótidos Iniciadores

• Se conoce su secuencia.
• Es el factor más importante para la eficiencia y la especificidad del proceso.
• Deben estar presentes en exceso (10¹³ = 30 ciclos, 1 kb).
• Requieren de un diseño cuidadoso.
• Reglas de diseño:
  • Longitud = 18-25.
  • Contenido de G+C entre 40-60%.

Clonamiento

• Vectores de clonamiento: permiten insertar secuencias de ADN (pBluescript, pBR322, pTOPO, pGEMT).
• Vectores de expresión: permiten sobreexpresar los genes clonados (pET-21a-d, pBAC).
• Huéspedes de clonamiento: células que portan un vector de clonamiento con un gen clonado.
• Huéspedes de expresión: células que pueden sobreexpresar un gen clonado en un vector de expresión.