Tecnología del ADN recombinante: PCR, secuenciación y clonación génica

Tecnología del ADN recombinante

Tecnología del ADN recombinante incluye técnicas como la localización del gen, la obtención de sondas moleculares de ácidos nucleicos monocatenarios para la hibridación (dos tipos: ADN-ADN, o transferencia de Southern, y ADN-ARN, o Northern).

Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR), desarrollada por Kary Mullis, permite obtener múltiples copias de un fragmento de ADN. Para ello:

• Se separa el ADN bicatenario en dos ADN monocatenarios.
• Se necesitan ADN monocatenario, dNTP y cebador; cada hebra sintetiza la otra cadena.
• Se repite un ciclo de síntesis: desnaturalización, con Taq polimerasa (una polimerasa termófila).

Métodos de secuenciación del ADN

1) Método de Sanger

El ADN se separa en dos hebras, que se usan como molde. Se une el cebador y se añade ADN polimerasa y los cuatro dNTP en cuatro recipientes distintos. Se obtienen fragmentos de longitud variable, que se separan por electroforesis: los más largos emigran más lentamente. Hood automatizó el proceso.

2) Secuenciación masiva

• Secuenciación de genomas completos (Craig Venter): el ADN se fragmenta al azar y se clona en una genoteca; las secuencias de los fragmentos se obtienen automáticamente y se alinean mediante ordenador (PC), con su posterior corrección.
• Pirosecuenciación: desarrollada por Mostafa Ronaghi, utiliza microesferas.

Mutagénesis dirigida

Provoca cambios en la secuencia de nucleótidos de un gen para obtener proteínas modificadas. Se necesita un oligonucleótido sintético con la secuencia mutada.

Tecnología del ADN recombinante: fases de la clonación

La clonación consta de las siguientes fases: aislamiento y obtención del gen, selección del vector clonador, formación del ADN recombinante, inclusión del ADN recombinante en una célula hospedadora, y selección de las células clonadas y expresión de los genes exógenos.

Generación de fragmentos de ADN

Las endonucleasas de restricción cortan el ADN en extremos romos o cohesivos. Otra posibilidad es la transcriptasa inversa, que permite obtener ADN sin intrones. También puede emplearse ADN sintético. Los fragmentos se separan por electroforesis en gel según su tamaño.

Unión del ADN recombinante a vectores de clonación (VdC)

Los vectores son pequeñas moléculas de ADN capaces de replicarse en células hospedadoras. Tipos:

• Plásmidos: moléculas de ADN circular, presentes en bacterias.
• Genomas de algunos virus: moléculas pequeñas de ADN que contienen su propio origen de replicación (por ejemplo, el fago lambda).
• Cromosomas bacterianos artificiales: plásmidos para clonar fragmentos grandes.
• Cósmidos: plásmidos modificados en los que se introduce información genética del fago lambda.

El vector y el ADN se tratan con la misma endonucleasa y ligasa.

Introducción en un hospedador

El hospedador debe tener crecimiento rápido, no ser patógeno ni peligroso, y ser capaz de captar ADN. En las procariotas, la introducción se realiza mediante transformación artificial o transducción.

Selección de células clonadas y expresión de los genes

1) Clonación en células procariotas

Se emplean vectores de expresión cuando se utilizan bacterias hospedadoras para clonar genes eucariotas. Deben ser adecuados para ello.

2) Clonación en células eucariotas

El gen que se desea clonar debe insertarse en un cromosoma celular para ser expresado. Vectores utilizados:

• Genomas de virus: algunos pueden introducir su genoma, y los retrovirus, su ADN; se elimina su virulencia.
• Cromosomas artificiales de levadura (YAC): moléculas de ADN recombinante estables en el núcleo, que se comportan como cromosomas.
• Plásmidos Ti: para la clonación en células vegetales. Agrobacterium tumefaciens los posee; codifican un sistema de transmisión del ADN al vegetal, lo que permite obtener organismos transgénicos.
• Métodos de introducción directa: microinyección con capilar, electroporación mediante impulsos eléctricos, y pistola de genes, que dispara microproyectiles recubiertos de ADN (en hongos, algas y vegetales).
• Liposomas: contienen ADN foráneo y se fusionan con la membrana celular.

Aplicaciones

• Estudios evolutivos, históricos y arqueológicos, mediante huellas dactilares del ADN.
• Productos de interés sanitario.
• Diagnóstico de enfermedades genéticas.
• Terapia génica.
• Organismos transgénicos.
• Clonación de seres vivos.