Técnicas de hibridación molecular: Southern blot, Northern blot, FISH, CISH y microarrays

Técnicas de Hibridación Molecular

Southern Blot

Dblot: varias muestras, cada una en una zona de la membrana. Radiación o haptenos... conjunto en cámara colectora, conectada a vacío. Lavar, desmontar sistema de vacío y lavar y secar. Hibri: las sondas de ADNdc se desnaturalizan antes de su uso y enfriamiento rápido en hielo. Haptenos: no rehibridan, porque los colorantes son insolubles e indelebles. Dblot inverso: afectan a distintas zonas génicas. Se inmoviliza en la membrana los oligos específicos. Se marca ADN paciente en PCR. Colonias: réplica, lisar células y desnaturalizar ADN, fijar ADN con calor o UV. (Sigue como Dblot) Virus: se replica placa viral de células huésped en cultivo y lisadas por los fagos.

Southern: varias secuencias diana de diferentes tamaños en una hibridación. Sondas radiactivas 33. 1-extraer y purificar, digerir con enzimas, fragmentos de diferentes tamaños, electroforesis. Foto para comparar patrón de bandas con resultado de hibridación. Transferir ADN a membrana, réplica patrón de bandas y desnaturalizar, capilaridad y anclaje. Hibridación, incubar membrana con reactivos en bolsa hermética. Se hará a temperatura y agitación. 1 solución prehibridación, 2 solución hibridación 1 o más sondas marcadas, 3 lavados con creciente rigurosidad 6, 2, 1. Revelado: película de rayos X. Se compara patrón de electroforesis con hibridación, identificar la secuencia diana en un fragmento de tamaño específico. Hallar genes, estudiar mutaciones estructurales, detectar secuencias adquiridas.

Northern Blot

Northern: gel de agarosa con formaldehído, la muestra se diluye en tampón con formamida y calentar a 65°C. Electroforesis en condiciones desnaturalizantes.

Captura de Híbridos

Captura híbrido: formar ADN/ARN, capturar con anticuerpos específicos. 1 lisis de virus y desnaturalizar ADN en solución alcalina. Hibridación con sonda de ARN, captura de híbrido, la mezcla se pasa a pocillo de microtiter, lavado, detección de híbrido, se añade un segundo anticuerpo marcado con fluoróforo, revelado, añadir sustancia química que por acción del enzima produzca una luz detectable con lector.

Microarrays

Microarrays: marcaje de muestra (estudios genómicos o expresión), hibridación y lavado (si el marcaje es con biotina, añadir estreptavidina marcada con fluoróforo), lectura del microarray, escáner láser que excita cada punto de la matriz con la longitud de onda del fluorocromo. Análisis e interpretación.

CGH

CGH: +/- material genético. En un array se estudian múltiples genes y cada gen puede tener muchas sondas específicas de regiones. No detectan cambios estructurales, translocaciones, inversiones.

Expresión Génica

Expresión génica: términos absolutos - híbrido de ADNc obtenido de ARNm de una población. ¿Qué genes se expresan y con qué intensidad en un momento concreto? Resultados: Rojo - muestra paciente, Verde - ADNc referencia. Verdes: genes reprimidos en la muestra que sí se expresan en células normales. Amarillos: se expresan sin alteraciones en la muestra. Naranjas: sobreexpresados en la muestra. Amarillo-verdosos: infraexpresados.

Hibridación In Situ (FISH)

IN SITU: la muestra debe ponerse en monocapa sobre un portaobjetos. Sondas no radiactivas. Detecta alteraciones numéricas y estructurales.

Preparación de la Muestra

Cromosomas en metafase: cultivos celulares detenidos en estadio de metafase - colchicina.

Núcleos en interfase: choque hipotónico, fijación con solución Carnoy (metanol/ácido acético glacial), extensión de núcleos.

Extensiones citológicas: a partir de fluidos biológicos con células en suspensión, se extienden intactas en monocapa. Se pone una gota manualmente o con citospin. Secar y fijar con etanol al 4%.

Protocolo FISH

Protocolo FISH: fijar muestra en portaobjetos, hibridar, 5 µl de sonda marcada con fluorocromo y cubrir con cubreobjetos. Placa en cámara húmeda y estufa, lavado post-hibridación, quitar cubreobjetos y sumergir en solución, contratinción, sacar del lavado y eliminar exceso de líquido. Añadir 5 µl de DAPI y cubrir con cubreobjetos. Visualización: microscopio de fluorescencia con filtros adecuados. El resultado se expresa como % de núcleos que presentan la alteración que se estudia.

FISH en Interfase

Fish INTERFASICA: usa sondas en función de la alteración: numérica o estructural. CEP - aneuploidías y poliploidías. o LSI - translocaciones, microdeleciones y microamplificaciones (por +/-, número de señales fluorescentes)

FISH en Metafase

Fish METAFASICA: detecta secuencias de ADN directamente sobre extensiones citogenéticas en metafase. 3 sondas.

Fish pintado de cromosomas enteros: numéricas y translocaciones, no deleciones, duplicaciones e inversiones.

Fish multicolor: identificación diferencial de regiones subcromosómicas. Sondas específicas de diferentes fluorescencias, un sistema de análisis de imagen pinta las bandas de los cromosomas en función del conjunto de fluorocromos de la región. Se obtiene un bandeado de color característico de cada cromosoma.

Cariotipo espectral: sondas WCP de cromosomas completos. Para cariotipos con muchas alteraciones numéricas y estructurales.

Hibridación In Situ con Cromógeno (CISH)

CISH: desparafinado e hidratación, digestión con enzimas, prehibridación, hibridación, etapa de codesnaturalización de la sonda y ADN de la muestra. Añadir 5 µl de sonda sobre el tejido y cubrir con cubreobjetos, colocar en cámara húmeda e incubar. Lavado post-hibridación: ir aumentando la rigurosidad, detección: si las sondas están marcadas con digoxigenina - añadir anticuerpo primario anti-digoxigenina, añadir anticuerpo secundario (biotina) frente al primario, estreptavidina marcada con fluoróforo, añadir sustrato cromógeno adecuado, la hidrólisis provocará un producto coloreado insoluble, contratinción, el tejido no es visible al microscopio, no se puede interpretar el resultado. Hacer una tinción suave, hematoxilina de Mayer, no enmascara el resultado de CISH y permite reconocer detalles morfológicos.