Recompte Cel·lular: Mètodes Manuals i Automàtics

Recompte cel·lular: Conceptes: El recompte quantitatiu dels elements formes de la sang ens permet determinar el nombre d'eritròcits, leucòcits i plaquetes per litre. Aquesta informació forma part de l'hemograma, on s'estudien altres paràmetres en cada anàlisi de pacient.

Etapes del recompte:

1. Dividir la mostra de sang del pacient.
2. Agafar un volum conegut.
3. Fer el recompte dels elements formes.
4. Càlcul matemàtic a partir de les dades obtingudes.

Dos mètodes de recompte:

• Manual: Més lent i amb major marge d'error.
• Automàtic: Més precís i ràpid.

Recompte manual amb cambra:

Material:

• Cambra de recompte de glòbuls
• Pipetes de dilució
• Líquid de dilució
• Microscopi òptic (eritròcits i leucòcits)
• Microscopi de contrast de fase (plaquetes)

Cambra de recompte de glòbuls: Són portaobjectes més gruixuts. Les dues plataformes laterals són 0,1 mm més altes i serveixen de suport al portaobjectes. A la plataforma central hi ha gravat un reticle de recompte, on queden les cèl·lules que comptarem. La diferència principal entre les cambres rau en el tipus de reticle. El més utilitzat és el Neubauer modificat o improved.

El quadrat principal fa 3 mm de costat i està dividit en 9 quadrats secundaris d'1 mm. Per al recompte, utilitzarem els quadrats secundaris dels vèrtex per als leucòcits i plaquetes, i el quadrat central per als eritròcits. Tots els quadrats secundaris tenen una superfície de 1 mm² i un volum de 0,1 mm³, excepte els dels vèrtex.

Subdivisió dels quadrats secundaris: Cada quadrat secundari està dividit en quadrats terciaris. Els quadrats secundaris dels vèrtex tenen 16 quadrats terciaris (0,25 mm de costat).

Recompte de leucòcits: Es compten els 64 quadrats terciaris dels extrems.

Recompte de plaquetes: Es compten les diagonals, 4 quadrats terciaris de cada extrem (total 16).

Pipeta de dilució o Thoma: És un tub de vidre que serveix per fer la dilució de la sang. Hi ha dos tipus de pipetes de Thoma, que es diferencien pel color de la perla que conté el dipòsit central.

• Vermella: Recompte d'eritròcits i plaquetes (per diluir més, ja que hi ha més eritròcits).
• Blanca: Recompte de leucòcits.

Graduació:

• Extrem llarg: 0,5 i 1
• Extrem curt: vermell 101 i blanca 11

Procés de dilució vermella (eritròcits i plaquetes):

1. Omplir amb sang fins a la marca de 0,5 o 1.
2. Omplir amb líquid de dilució fins a la marca del 101 (al capil·lar curt).

Nota: Enràs molt exacte.

Dilució amb pipeta de perla blanca (leucòcits): El líquid de dilució s'introdueix amb xucladors. Es mescla i s'omple la cambra de recompte. S'omple i es buida per capil·laritat. Per buidar, posar en contacte amb una cantonada d'una cel·la. No porta anticoagulant, hem d'introduir el líquid de dilució ràpidament per evitar la formació de coàguls. Un cop buidada, s'ha de rentar la pipeta.

Líquid de dilució: Hi ha tres tipus, segons els elements sanguinis. La seva funció és diluir la mostra de sang i facilitar el recompte de les cèl·lules d'interès.

• Líquid de Hayem (eritròcits): Biclorur de mercuri (tòxic per als leucòcits). Sense tinció (eritròcits vermells). Microscopi òptic.
• Líquid de Turk (leucòcits): Colorant violeta de genciana. Àcid acètic glacial (tòxic per als eritròcits). Microscopi òptic.
• Líquid diluïdor per a plaquetes: Oxalat d'amoni (tòxic per als eritròcits i leucòcits). Microscopi de contrast de fase.

Mètode de recompte manual:

Dilució de la mostra de sang: Líquid de dilució idoni per a les cèl·lules a comptar. Tipus de dilució (més cèl·lules → més dilució). Dilució exacta i correcta. Abans d'afegir el líquid, netejar la sang sobrant de la pipeta.

Omplir la cambra de recompte: Abans d'omplir, tocar el paper 2 o 3 cops perquè entri sang diluïda. La cambra s'omple per capil·laritat, tocant amb la pipeta l'espai de 0,1 mm entre el cubreobjectes i la cel·la central, sempre per una cantonada. Si omplim un reticle amb cèl·lules que han precipitat, no serveix. Hi ha pipetes que fan la dilució automàticament.

Recompte fiable: Visualitzar la mostra del reticle i assegurar-se que estigui homogèniament distribuïda. Per no repetir cèl·lules, només es compten les que toquen la línia superior dreta.

Causes d'error: L'error aproximat és del 20%. En leucòcits i plaquetes, l'error és menor, ja que n'hi ha menys.

Errors relacionats amb la mostra:

• La sang capil·lar utilitzada no flueix, es trenca i el recompte és inferior.
• Utilització de sang anticoagulada on s'ha barrejat erròniament.

Errors relacionats amb el material:

• Recipient brut.
• Dilució incorrecta.
• Material mal calibrat.
• Líquids de dilució caducats o espatllats.

Errors relacionats amb la tècnica:

• Omplir incorrectament la pipeta.
• No treure les quatre primeres gotes.
• Distribució no uniforme.
• Comptar malament.

Errors relacionats amb el càlcul: Errors de dilució i de volum.

Recompte indirecte de plaquetes: Obtindrem el recompte de plaquetes per mm³ o L sense fer el recompte de plaquetes amb la cambra. Les plaquetes es recompten amb microscopi de contrast de fase.

1. Recompte de leucòcits en cambra.
2. Frotis amb tinció i busquem zona amb 100 eritròcits i relacionem amb plaquetes.
3. Segons regla de tres, busquem les plaquetes/L.

Mirar el frotis a 100x ja que n'hi ha 100 eritròcits, per tant comptem les plaquetes. L'error d'aquest mètode és major que el recompte manual.

Recomptes automàtics: Més precisos, amb un error menor i més ràpids. Hi ha diferents tipus de comptadors:

• Els més simples: Diferencien eritròcits, leucòcits i plaquetes.
• Els més avançats: Diferencien tipus de leucòcits i limfòcits B, T4, T8.

Parts dels comptadors automàtics:

• Diluïdor: S'encarrega de fer la dilució de la mostra del pacient.
• Cambra de flux: Assegura que les cèl·lules passin de una en una per poder fer el recompte.
• Dispositiu de mesura: Detecta el pas de cada una de les cèl·lules.
• Transductor: Tradueix les senyals emeses pel dispositiu i les transforma en nombres.
• Equip informàtic: Dóna un informe amb els resultats.

Dispositiu de mesura:

A. Mètode de la resistència elèctrica/Coulter: A la cambra hi ha dos elèctrodes pels quals passen les cèl·lules sanguínies. Cada cop que passa una cèl·lula, presenta una resistència que depèn de cada element sanguini. Si ens fixem en la mida: leucòcits més grans → més resistents.

Complexitat: Diferenciar els leucòcits entre si. Neutròfils: més complexos → més resistents. Limfòcits: menys complexos → menys resistents. El transductor serà el que classificarà cada senyal en leucòcits, plaquetes i diferents tipus de leucòcits.

B. Mètodes òptics o de dispersió lumínica: Dos tipus:

Camp fosc:

Quan no hi ha elements sanguinis (repòs): Va passant la dilució, i la cambra està travessada per un raig de llum que no es desvia (no hi ha elements), i incideix en un disc de camp fosc. El disc absorbeix la llum de forma que el fotodetector de llum no detecta res (no arriba llum).

Quan hi ha cèl·lules (actiu): Si passa una cèl·lula, el raig es desvia, no toca el disc, i va al fotodetector, rep una senyal per cada cèl·lula que passa. Com més gran i complexa sigui una cèl·lula, més gran serà l'angle de dispersió del raig de llum. I el transductor ho classifica.

Raig làser: Més sofisticat i més informació.

Repòs: La cambra està travessada per un raig làser, quan passa el líquid, incideix de forma contínua en un sensor.

Actiu: Cada cop que passa un element sanguini, aquest raig es desvia i no incideix en el sensor. El recompte de cèl·lules es fa a partir de quants cops el sensor no rep senyal. Depenent de la cèl·lula, el raig es desvia més o menys i sempre que es desvia toca un disc de dispersió, i depèn on toqui és una cèl·lula o una altra.

Tipus de comptadors: Es diferencien pel nombre de poblacions.

• Comptador d'una població: Utilitza la resistència elèctrica com a dispositiu de mesura, i dóna el recompte d'eritròcits, plaquetes i leucòcits. Consta de dos diluïdors i dues cambres de flux. Un diluïdor i una cambra per a leucòcits, les altres per a plaquetes i eritròcits.
• Comptador de tres poblacions: Eritròcits, plaquetes i leucòcits grans (neutròfils), mitjans (monòcits, eosinòfils, basòfils) i petits (limfòcits). Utilitza el mètode òptic de camp fosc, dos diluïdors i dues cambres. Un diluïdor i una cambra per a eritròcits i plaquetes, i la resta per als leucòcits.
• Comptadors de cinc poblacions: Eritròcits, plaquetes i cinc tipus de leucòcits per separat. Dóna la concentració d'hemoglobina que té la persona. Té quatre canals:

Canal 1: Peroxidasa: Aporten reactius necessaris perquè treballi la peroxidasa dels leucòcits, i obtenir un color groc en funció de la quantitat de peroxidasa que tenen els leucòcits. Hi ha un fotòmetre que mesura la intensitat. Un fotodetector mesura l'angle de dispersió. El transductor compara la senyal del fotòmetre i el fotodetector.

La peroxidasa informa del nombre de:

• Limfòcits (no es tenyeixen, no tenen peroxidasa)
• Eosinòfils (peroxidasa alta)
• Neutròfils (activitat peroxidasa positiva)
• Monòcits i basòfils (peroxidasa alta)
• Leucòcits (peroxidasa nul·la)

Canal 2: Basòfils: Utilitza un reactiu que és un colorant blau alciant, que tenyeix els basòfils. I com sempre, fotodetector, fotòmetre i transductor.

Canal 3: Eritròcits i plaquetes: El diluent té un reactiu que trenca els leucòcits. Hi ha dos fotodetectors: plaquetes i eritròcits.

Canal 4: Cianometahemoglobina: Calcula la concentració d'hemoglobina del pacient. Amb un reactiu es trenquen els eritròcits per alliberar l'hemoglobina, després s'afegeixen els reactius per transformar l'hemoglobina en cianometahemoglobina. El fotòmetre detecta la intensitat del color de la cianometahemoglobina i així sap la concentració d'hemoglobina.

D. Citòmetre de flux: L'únic que utilitza el dispositiu de raig làser. Es detecta la desviació del raig per FSC.

Presentació dels resultats:

Llistat: Pot anar amb sigles o escrit amb el nombre i les unitats que hem fet servir. Per poder entendre els resultats, va acompanyat del rang de normalitat.

Histograma o polígon de freqüència: Ens donen informació d'una característica dels elements sanguinis d'una persona.

Diagrames de dispersió: Relacionen dues característiques dels elements sanguinis de la persona (es situa cada cèl·lula en un punt del diagrama).

Causes d'error en els recomptes automàtics: 1% d'error, per això són més fiables i ràpids. Però pot haver-hi error.

Errors segons la mostra:

• Manipulació de la mostra.
• Malament barrejat.
• Error de coincidències.
• Hemòlisi.
• Presència de coàguls.
• Agregats plaquetaris.

Errors segons l'aparell:

• Utilització d'un diluent inadequat.
• Calibratge erroni de la màquina.
• Neteja defectuosa.
• Propis de l'aparell.