Fundamentos de Secuenciación de ADN, Vectores de Clonación y Técnica de PCR

Secuenciación Enzimática

Se basa en sintetizar la cadena de DNA complementaria a aquella que se quiere secuenciar, en unas condiciones en que sea posible detener, de forma controlada y en puntos concretos, su crecimiento. Los componentes de la secuenciación son:

• DNA molde o segmento de DNA.
• DNA polimerasa.
• Primers o cebadores.
• Nucleótidos trifosfato.
• Nucleótidos didesoxi: son nucleótidos que han perdido el grupo hidroxilo de la posición 3’ de la desoxirribosa. Una vez se incorporan, se termina la síntesis de DNA.

Mecanismo de la secuenciación

1. Cuatro tubos diferentes con cuatro mezclas de reacción.
2. En cada mezcla se producen una serie de moléculas de nueva síntesis con diferente longitud, terminando todas en el mismo nucleótido y marcadas radiactivamente en el extremo 5’.
3. Separación de los fragmentos de DNA de nueva síntesis obtenidos por tamaños mediante electroforesis en geles verticales de acrilamida, permitiendo distinguir fragmentos de DNA que se diferencian en un solo nucleótido.
4. Una vez terminada la electroforesis, se pone el gel en contacto con una película fotográfica de autorradiografía. Cada una de las bandas indica que en ese punto está la base correspondiente al nucleótido didesoxi.
5. Se realiza la lectura del DNA de nueva síntesis, que crece en dirección 5’-3’.

¿Qué es un vector de clonación?

Un vector de clonación es una molécula de DNA a la cual puede unirse un fragmento de DNA extraño para introducirse en una célula donde se replicará en gran número de copias.

Características de los vectores

• Origen de replicación propio.
• Marcador seleccionable.
• Sitios de restricción únicos.

Ejemplos de vectores de clonación

• Plásmidos: moléculas de DNA circulares de bacterias.
• Fago lambda: virus bacteriófago.

Características del gen de transcripción

Es una secuencia de DNA localizada en una región próxima al inicio de la transcripción que es reconocida por el aparato transcripcional. Posee una región promotora que se encuentra en el inicio de la región de transcripción. A la derecha estamos "aguas abajo" y a la izquierda "aguas arriba". Además, tiene una región que va a dar lugar al RNA y, finalmente, el terminador donde termina la transcripción.

Diseño de Primers y PCR

La PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa) se trata de la replicación del DNA, catalizada por una DNA polimerasa. Se debe conocer la secuencia nucleotídica de los fragmentos del extremo de DNA que se desea copiar, ya que se utilizan dos cebadores que hibridan con los extremos a partir de los cuales actúa la DNA polimerasa.

Componentes de la PCR

• DNA amplificado.
• Primers: punto de partida para la replicación del DNA.
• Desoxirribonucleótidos trifosfato: sustratos para polimerizar nuevo DNA.
• DNA polimerasa.
• Cloruro de magnesio: en altas concentraciones disminuye la especificidad de la reacción.
• Buffer o tampón: para que la enzima pueda actuar.
• Termociclador.

Mecanismo de la reacción

• Desnaturalización (94 ºC): separación de la doble hélice de DNA elevando la temperatura.
• Hibridación (50-60 ºC): anclaje de los cebadores.
• Elongación (72 ºC): extensión de los fragmentos flanqueados por los primers gracias a la DNA polimerasa.