Crecimiento bacteriano: métodos de estimación y recuento de células

Crecimiento bacteriano

Se mide a partir de los cambios en el número de células o en la concentración de algún componente celular como la estimación del número de células. Se puede expresar en función del aumento de la masa del cultivo o el aumento del número de células. Debido a que las poblaciones bacterianas son grandes, la mayoría de métodos utilizan mediciones de muestras pequeñas de las cuales para saber el tamaño de la población total se utilizan cálculos. Ninguna técnica es completamente conveniente o satisfactoria en todos los casos. Se debe analizar la posibilidad de errores e interferencias a la hora de interpretar los resultados.

Estimación de la masa celular: ● Determinación del peso húmedo: es una muestra microbiana en suspensión que es pesada luego de la separación de las células a través de la centrifugación. Esta técnica es aplicable a hongos filamentosos, levaduras y bacterias ; aunque puede haber grandes errores en los resultados debido a que el líquido pueda quedar retenido en el interior de la célula.

Este procedimiento se realiza de la siguiente forma:

a. Tarar un tubo de centrífuga b. Centrifugar el cultivo (5ml de muestra original en los tubos) a 400 RPM por 10 minutos. C. Eliminar el sobrenadante d. Determinar el peso del sedimento celular

Determinación del peso seco

Determina la cantidad de biomasa de una muestra. El sedimento se seca antes de ser pesado. Esta técnica es aplicable a hongos filamentosos, levaduras y bacterias; aun así, este método requiere mucho tiempo y tiene bastantes errores. Se deben utilizar balanzas analíticas. Este procedimiento se realiza igual que el anterior pero antes de pesar el sedimento, este debe ser secado a 105°C toda la noche (hasta lograr un peso constante) antes de pesarlo.

1 mg de peso seco = (aproximadamente) 5x10 bacterias.

*Para ambas determinaciones se realizan 3 repeticiones en 3 tubos de ensayo previamente pesados e identificados.

Métodos turbidimétricos (ópticos):

Se basa en la capacidad de las células y partículas en general de absorber y/o dispersar la luz que incide sobre ellas. La turbidez es proporcional al número de células. Este método es fácil, rápido y aplicable a organismos unicelulares, aun así, muchos MOs no crecen en medios líquidos o si lo hacen, lo realizan formando biopelículas o grumos.

MÉTODOS DE RECUENTO DE POBLACIONES MICROBIANAS:

Se puede medir con un espectrofotómetro (este hace pasar la luz a través de la suspensión celular y detecta la luz no dispersada).

Mayor n° de células = mayor turbidez del cultivo, mayor densidad óptica y menor cantidad de luz no dispersada.

Estimación del número de células:

●

Recuento total de células al microscopio:

Este método es rápido, sencillo y económico aunque solamente sirve para suspensiones relativamente concentradas (>10 cel/ml 6 ). Para las bacterias móviles, se deberán inmovilizar con una mezcla de alcohol y agua. Este método se puede aplicar a levaduras, bacterias y esporas fúngicas.
La cámara especial de contaje que normalmente se utiliza es la de Petroff-Hauser que consiste en 25 cuadrados grandes, cada uno dividido en 16 cuadrados más chicos. 

El procedimiento para realizar este método es: 1. Colocar la muestra en la cámara especial de contaje entre un portaobjetos y cubreobjetos. 2. Dejar reposar la muestra sobre la plataforma del microscopio unos minutos. 3. Contar el número de células en varias celdillas o cuadrados (mínimo 5). 4. Calcular la media.

formula:

𝑥 cantidad de células x 25 cuadrados grandes x 50 (factor del Vol. De la cámara) x 10 3 = 𝑥 cantidad de células/ml

●

Método del número más probable:

su fundamento es que para que se observe un desarrollo en el tubo de una serie de diluciones de una muestra sembrada en tubos con medio líquido, debe haber por lo menos una célula en el inóculo sembrado.

●

Recuento sobre filtros de nitrocelulosa:

Se usa para suspensiones diluidas de bacterias. Se hace pasar un gran volumen de suspensión a través de una membrana de nitrocelulosa estéril, que retiene las bacterias. Posteriormente, el filtro se deposita sobre la superficie de un medio de cultivo sólido. Las colonias se forman sobre el filtro y se cuentan, deducíéndose la concentración original en función del volumen de suspensión que se hizo pasar por el filtro.

● Recuento de viables en placa: Permite la determinación de MOS presentes en una muestra en base a su desarrollo en medio de cultivo en placas (solo las células microbianas viables en las condiciones de trabajo elegidas podrán ser utilizadas). Se puede aplicar a levaduras, bacterias y hongos filamentosos. Se mide el número de células viables pero requiere bastante tiempo (alrededor de 24 hrs o más) para formar colonias viables. Este método es útil para el control de calidad de aguas.Los resultados se expresan como unidades formadoras de colonias por gramo o mililitro (UFC/g o UFC/ml).

Pasos: 1. Diluir la muestra 5 veces 2. Sembrar 1 ml de cada disolución en forma de placa invertida o 0.1 de cada dilución (alícuota) en siembra en superficie. 3. Incubar dichas placas. 4. Determinar cantidad de colonias.

Los resultados