Técnicas Esenciales en Biología Molecular: Footprinting, Transformación Bacteriana y Vectores de Clonación

Técnicas Fundamentales en Biología Molecular

DNA Footprinting: Principios y Aplicaciones

El DNA footprinting es una técnica crucial para identificar sitios de unión a proteínas en el ADN. Permite determinar con precisión las secuencias de ADN con las que interactúan las proteínas.

Ventajas y Desventajas del DNA Footprinting

• Su tamaño facilita la protección física del ADN.
• Se controla fácilmente añadiendo EDTA para detener la reacción.
• La enzima no corta el ADN aleatoriamente; su actividad se ve afectada por la estructura y la secuencia del ADN local y, por lo tanto, resulta en una escalera desigual.

Método de DNA Footprinting

1. La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) amplifica y marca la región de interés que contiene un potencial sitio de unión a proteínas.
2. Añadir proteína de interés a una porción del ADN molde marcado.
3. Añadir un agente de escisión, como la DNasa I, a ambas porciones del ADN molde.
4. Ejecutar ambas muestras lado a lado en una electroforesis en gel de poliacrilamida.
5. Marcado de las muestras para visualización.

Interpretación del DNA Footprinting

A medida que aumenta la cantidad de proteína presente, el área de huella se protege progresivamente de la escisión. La concentración de proteína requerida para dar una protección del 50% puede estar matemáticamente relacionada con la constante de equilibrio de unión a proteínas.

Transformación Bacteriana: Métodos y Tipos

La transformación bacteriana es un proceso fundamental en ingeniería genética que permite la introducción de ADN exógeno en células bacterianas, lo que resulta en un cambio en sus características genéticas.

Tipos de Transformación de E. coli

Existen diversas metodologías para inducir la competencia en E. coli, facilitando la captación de ADN externo.

Bacterias Químicamente Competentes

En este procedimiento, las E. coli son tratadas con tampones que contienen CaCl₂ y otras sales. Este tratamiento produce un choque osmótico en la célula y crea poros temporales en la membrana por donde podrá entrar el ADN exógeno.

Bacterias Electrocompetentes

Para realizar este proceso se necesita una gran cantidad de células y un aparato especial que produce un pulso de electricidad. Este pulso altera las cargas de la membrana, permitiendo la entrada de los plásmidos.

Transformación Artificial

• La transformación artificial se lleva a cabo en el laboratorio mediante diversas técnicas, entre ellas el tratamiento de las células con cloruro de calcio o la ya mencionada electroporación, que aumenta la permeabilidad de sus membranas al ADN. Este enfoque tiene éxito incluso con especies que no son competentes de forma natural, como E. coli.
• Para aumentar la frecuencia de transformación se utilizan concentraciones relativamente más altas de ADN que las que hay naturalmente.
• Resulta más sencillo transformar bacterias con ADN plasmídico, ya que los plásmidos no se degradan con tanta facilidad como los fragmentos lineales y son capaces de replicarse dentro del huésped.
• Este es un método habitual para introducir ADN recombinante en las células bacterianas. Puede introducirse ADN de cualquier fuente en las bacterias insertándolo en un plásmido antes de la transformación.

Transformación Natural

Consiste en la captación por parte de una célula receptora de una molécula o fragmento de ADN desnudo y la incorporación de esta molécula al cromosoma del receptor en una forma heredable. En la transformación natural, el ADN procede de una bacteria donadora. Es un proceso aleatorio, y puede transferirse cualquier porción del genoma entre bacterias.

Transformación por Electroporación

Consiste en la utilización de pulsos de campo eléctrico de alta tensión y corta duración, los cuales crean agujeros o poros temporales en la membrana celular, que luego se vuelven a sellar por la capacidad autosellante de la membrana.

Vectores de Clonación: Cósmidos y Fagos Lambda

Los vectores de clonación son herramientas esenciales en ingeniería genética para introducir y replicar fragmentos de ADN en células huésped.

Cósmidos

Vectores híbridos construidos utilizando partes del cromosoma del fago lambda y de ADN plasmídico. Los cósmidos contienen la secuencia "cos" del fago lambda, necesaria para el empaquetamiento del ADN del fago dentro de su cubierta proteica, y secuencias plasmídicas de replicación y de genes de resistencia a antibióticos, que permiten identificar las células huésped que los contienen. El ADN de los cósmidos que contiene insertos de ADN se empaqueta en la cápside proteica de lambda para formar partículas fágicas infectivas.

Fagos Lambda

Se extrae el ADN de una preparación de fago lambda y se elimina el grupo central de genes por tratamiento con una enzima de restricción. El ADN a clonar se corta con la misma enzima y se liga entre los brazos del cromosoma de lambda. Luego se empaqueta el cromosoma recombinante dentro de las proteínas del fago para formar un virus recombinante. Este virus puede infectar células bacterianas y replicar su cromosoma, incluido el inserto de ADN.