Sondas de ADN y ARN: tipos, marcaje y proceso de hibridación

Una sonda es una copia de un gen o de un fragmento de ADN/ARN que queremos estudiar. Se trata de una molécula de ADN/ARN homóloga a una secuencia de ADN/ARN diana con la que se une o hibrida por asociación de bases complementarias.

Criterios para seleccionar una sonda

• Que no tenga secuencias complementarias a otras regiones del genoma distintas a las que queremos estudiar.
• El tamaño de la sonda influye en la especificidad: a menor tamaño, menor especificidad.
• Debe estar marcada con alguna molécula detectable para que la podamos cuantificar.
• El tamaño de la sonda influye en la sensibilidad.

Tipos de Sondas

Sondas Convencionales (Clonación Celular)

Son secuencias de ADN bicatenario que tienen que ser desnaturalizadas para su uso. Son de gran tamaño y se obtienen por clonaje de un vector plasmídico.

Pasos para la obtención de sondas por clonación celular:

1. Fragmentación de un ADN de partida con enzimas de restricción y separación por electroforesis del fragmento de interés.
2. Inserción del fragmento en un plásmido mediante una ligasa, que crea un ADNr.
3. Introducción del ADNr en una bacteria, que se multiplica replicando el ADNr.
4. Aislamiento de los clones, purificación del plásmido y separación del inserto con enzimas de restricción.

Sondas Obtenidas por Clonación Acelular

Se pueden obtener sondas de ADN bicatenario o, con la PCR, ADN monocatenario. También se pueden obtener sondas de ADNc bicatenario mediante la transcriptasa inversa. El ADNc no tiene intrones.

Sondas Sintéticas

Son monocatenarias y se obtienen por síntesis química. Utilizan sintetizadores que forman repetitivamente un enlace éster en 3'-fosfato y 5'-OH para hacer enlaces fosfodiéster.

Ventajas de las sondas sintéticas:

• Fácil y barato.
• Poco tiempo de hibridación.
• Detecta mutaciones puntuales.

Marcaje de Sondas

Se marcan los nucleótidos de la sonda de ADN con moléculas detectables que se van incorporando mediante síntesis enzimática en la que actúa una ADN polimerasa I.

Nick Translation

• Requiere una ADNasa que rompe aleatoriamente los enlaces fosfodiéster entre los nucleótidos de la sonda. Esto produce unos nicks en los cuales la ADN polimerasa irá uniendo nucleótidos marcados.
• Sustitución de un 30-60% de nucleótidos originales por marcados.
• Obtenemos una sonda de ADN bicatenario marcada de alta sensibilidad.
• Útil para marcar sondas de ADN grandes de doble cadena.
• No requiere desnaturalización.
• Fácil, rápido y económico.
• Existen reactivos comercializados.

Proceso de Hibridación

Para llevar a cabo la hibridación, se necesita:

1. Una muestra con fragmentos de ADN bicatenario diana.
2. Una sonda de nucleótidos marcada para luego detectarla.
3. Medios de reacción para la sonda y el ADN diana.
4. Un soporte para hacer la hibridación.

Pasos del proceso de hibridación:

1. Desnaturalización del ADN diana en medios adecuados.
2. Desnaturalización de la sonda en medios adecuados si es de doble cadena.
3. Mezcla de ADN diana y sonda sobre un soporte.
4. Dejar un tiempo de hibridación de los fragmentos mezclados en medio y condiciones adecuadas de temperatura.
5. Lavado de los restos de sondas marcadas y ADN diana que no han formado heterodúplex (sino homodúplex).
6. Detección del marcaje y estudio de la región unida a la sonda marcada.

Factores que influyen en la hibridación

• Composición de las bases: Influye en la estabilidad. Los enlaces G-C son más estables que los A-T.
• Tiempo y concentración del ADN/ARN: A mayor concentración de ADN, mayor número de copias de las secuencias complementarias. A mayor tiempo de hibridación, mayor número de secuencias de reasociación.
• Concentración de la sonda y ADN diana.
• Medios de reacción y lavado: Sales, agentes químicos, pH, polímeros inertes.
• Tamaño de la sonda.
• Temperatura de incubación.