Protocolo y Control de Calidad en la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)
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Fases Finales de la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)
Amplificación Final
Terminados los ciclos, la temperatura de elongación se mantiene por 5 minutos, lo que permite que la polimerasa termine la extensión de los productos a los cuales se encuentra unida. La temperatura habitual es de *72-75 °C*.
Almacenamiento Temporal
Durante la programación de los ciclos, se programa un ciclo final de *4 °C* por varias horas, lo que permite conservar los productos de PCR hasta que se retiren los tubos de reacción del equipo.
El Termociclador: Equipo Esencial para la PCR
El termociclador es el equipo en el cual se realiza la PCR. Facilita la automatización del proceso, permitiendo calentar y enfriar tubos de reacción rápidamente y de forma exacta y precisa para controlar la temperatura necesaria para cada etapa de la reacción. Normalmente, los rangos de temperatura de trabajo van de *4 °C a 96 °C*.
Los equipos cuentan con una placa metálica a manera de tapa, la cual se mantiene a *103 °C* para evitar la evaporación de la mezcla de reacción durante la desnaturalización. Para el enfriamiento, el equipo cuenta con flujos de aire frío.
Todos los aparatos llevan un microprocesador para programar las etapas de cada ciclo con sus temperaturas y duración específicas.
Visualización de Productos de PCR Convencional
La visualización se realiza por electroforesis en geles de agarosa o de acrilamida. La electroforesis permite separar fragmentos de acuerdo con su tamaño. Los fragmentos de ADN (cargados negativamente) se desplazan por el gel a través de un campo eléctrico hacia el polo positivo. Los fragmentos más pequeños migran más rápido y son los que se observan en la parte inferior del gel. El producto amplificado se visualiza como una banda.
Estrategias para Evitar la Contaminación en PCR
Un punto clave en la PCR es la minimización de la posibilidad de contaminación. Las posibles fuentes de contaminación son muestras biológicas, ácidos nucleicos usados como molde en PCR, así como los amplicones (producto de PCR).
Flujo de Trabajo Uni-direccional y Áreas de Laboratorio
Lo ideal es trabajar en tres áreas diferentes separadas físicamente, a las cuales se debe acceder siguiendo un camino en el cual, una vez llegada a la última área, no es posible regresar (flujo uni-direccional). Es fundamental contar con materiales de trabajo independientes en las distintas áreas:
Preparación de las Muestras (Área Pre-PCR)
Esta área debe contar con su juego de pipetas y zona UV para descontaminación, destinada a la realización de mezclas de reacción. Lo ideal es que cuente con un sistema de presión positiva.
Montaje de la PCR (PCR-Setup)
Aquí se agregará a los tubos preparados en el área 1, tubo a tubo, el ADN molde. Siempre se debe incluir un tubo blanco de reacción que debe tener todos los componentes de la mezcla, excepto el molde, que se sustituye con agua. Se pueden hacer dos blancos:
- Uno que se cierra en el área pre-PCR, que permite detectar si hay contaminación de reactivos.
- Otro que se deja abierto para asegurar que no hubo contaminación durante la manipulación.
En el caso de contar con un control positivo, es recomendable incorporarlo en cada tanda de reacciones. Es recomendable que esta área tenga presión negativa.
Amplificación y Detección (Área Post-PCR)
Se pasa al termociclador y a la visualización de fragmentos amplificados. Esta zona es conocida como *área post-PCR*. Es recomendable que tenga presión negativa.
PCR Múltiple (Multiplex PCR)
La PCR Múltiple es una variante de la PCR convencional. Es una técnica en la cual se amplifica más de una secuencia en la misma reacción. Emplea dos o más pares de cebadores en un único tubo con el fin de amplificar simultáneamente diferentes fragmentos de ADN.
Esta técnica ahorra tiempo y reactivos. Sin embargo, presenta un inconveniente: el diseño de los cebadores debe ser adecuado para permitir la detección de cada diana y no inhibir la amplificación de las demás.