PCR, Electroforesis en Gel de Agarosa, Southern Blot y Northern Blot: Técnicas Fundamentales de Biología Molecular
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Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)
La PCR permite amplificar un gen o un fragmento de ADN o ARN presente en cantidades mínimas dentro de mezclas (homogeneizados, sangre completa) sin necesidad de purificación previa.
Master Mix
La mezcla maestra (Master Mix) contiene:
- Tampón
- ADN polimerasa
- dNTPs
- Cloruro de magnesio
A continuación, se añaden el ADN molde y los primers adecuados.
Etapas del ciclo de PCR
1. Desnaturalización inicial
94 ºC (10 min): separa las cadenas de ADN.
2. Desnaturalización (inicio de cada ciclo)
94 ºC (1 min): desnaturalización al comienzo de cada ciclo.
3. Hibridación (anillamiento)
50-65 ºC (30 s, depende de la pareja de primers): hibridación de los primers al ADN.
4. Elongación
72 ºC (30 s-1 min): unión de la ADN polimerasa y amplificación del fragmento.
5. Elongación final
72 ºC (5 min): terminación de los productos.
6. Almacenamiento temporal
4 ºC: almacenamiento temporal de las muestras.
Electroforesis
La electroforesis es una técnica de separación molecular. El ADN, el ARN o las proteínas se separan en una matriz de gel según su peso molecular, al aplicar un campo eléctrico que atrae las moléculas en una dirección determinada.
Electroforesis en gel de agarosa
Se utiliza para separar, identificar y purificar fragmentos de ADN o ARN, y para cuantificar el tamaño de dichos fragmentos.
Preparación de un gel al 1%
- Añadir 1 g de agarosa a 100 ml de solución tampón TBE o TAE y calentar.
- Esperar a que enfríe hasta que no se produzcan vapores.
- Añadir bromuro de etidio o GelRed.
- Verter en la bandeja de geles, colocar el peine y dejar solidificar.
Southern Blot
El Southern blot es una técnica de transferencia e hibridación de ácidos nucleicos en un soporte sólido. Se utiliza para detectar secuencias de ADN cromosómico y cuantificarlas de forma relativa.
Northern Blot
El Northern blot es una técnica análoga al Southern blot, con la diferencia de que los fragmentos de ácido nucleico diana son de ARN en lugar de ADN. Permite detectar ARN y ARN mensajero.