Ingeniería Genética y Clonación Molecular: Fundamentos, Enzimas de Restricción y Plásmidos

Introducción a la Ingeniería Genética y Clonación Molecular

En 1953, Watson y Crick propusieron el modelo de la doble hélice como estructura del ADN. La construcción de moléculas de ADN recombinante y artificial se denomina Ingeniería Genética, a causa de su potencial para crear nuevas combinaciones genéticas por medios bioquímicos.

El proceso también se denomina clonación molecular o clonación genética, porque se puede propagar en una estirpe de organismos genéticamente idénticos, los cuales todos contienen la molécula compuesta y al crecer la amplifican, así como cualquier producto génico cuya síntesis sea dirigida por ella.

Para clonar (multiplicar) un fragmento de ADN se requiere de los siguientes pasos:

• Obtener el fragmento de ADN que se pretende clonar.
• Obtener y purificar el vector de clonado.
• Digerir y ligar las moléculas de ADN (foráneo y vector) de tal manera que nos permita crear la molécula recombinante. Las reacciones de corte y ligación utilizadas deben poder ser comprobadas fácilmente por el uso de electroforesis en gel.
• Introducir la construcción obtenida en el organismo hospedador adecuado (bacterias, levaduras, células de insecto, otros sistemas eucariotas).
• Crecimiento y selección de los organismos portadores de la molécula recombinante.
• Obtener y purificar la nueva molécula de ADN.

Enzimas de Restricción

En los organismos procariotas existe el mecanismo de restricción regulado por el huésped que les permite a las bacterias distinguir lo propio de lo ajeno. Involucra la modificación y la restricción.

Tiene como objetivo controlar la entrada de ADN exógeno, y las endonucleasas responsables de la degradación de ese ADN se denominan endonucleasas de restricción. La bacteria protege su propio ADN contra los efectos letales de sus endonucleasas y para ello modifica su ADN metilando ciertas bases de las secuencias de ADN que constituyen las secuencias de reconocimiento de las enzimas de restricción.

Las enzimas de restricción (ER) reconocen una secuencia nucleotídica específica de doble cadena en la molécula de ADN y la cortan o “digan” dejando extremos romos (de doble cadena) o cohesivos (de simple cadena complementarias entre sí).

Hay gran cantidad de endonucleasas de restricción que reconocen y digieren el ADN en secuencias concretas de tetra, penta, hexa o hepta nucleótidos (“secuencias palindrómicas”), que se caracterizan por tener un eje de simetría, así ambas cadenas poseen la misma secuencia 3’-5’. Ejemplo: 5’ cttaag 3’ / 3’ gaattc 5’.

Plásmidos y Clonación

Los plásmidos son moléculas de ADN circular cerrado covalentemente (CCC) que poseen los procariotas y se heredan de manera estable en estados extracromosómicos.

Implica homogenización genética, tamaño pequeño de las unidades monoméricas y la capacidad de replicarse independientemente del cromosoma.

Genes existen en los plásmidos codificando para distintas características fenotípicas como: resistencia a antibióticos, producción de antibióticos, resistencia a metales pesados, degradación de compuestos aromáticos.

Pueden ser modificados para utilizar como vectores de clonado (para amplificar un fragmento de ADN de interés), o como vectores de expresión (donde el fragmento de ADN insertado codifica para alguna proteína de interés).

Características generales de un vector de clonación son: bajo peso molecular, contener un origen de replicación, tienen capacidad de conferir características fenotípicas fácilmente seleccionables en las células huésped (ejemplo: contener un gen de resistencia a algún antibiótico) y poseen un sitio poli-linker o “MCS”, el cual es una pequeña región con alto número de secuencias reconocidas por diferentes endonucleasas de restricción.

El proceso de clonación consiste en insertar el fragmento de ADN exógeno en un vector y su posterior incorporación en un organismo receptor adecuado como se mencionó anteriormente. Como la eficiencia de esta incorporación es muy baja, es esencial que el plásmido tenga algún fenotipo fácil de identificar. Generalmente este es un gen de resistencia a un antibiótico contenido en el plásmido, de manera que sólo crecen las colonias que efectivamente incorporan el vector.

Para corroborar que el plásmido incorporado en el organismo hospedador contiene el fragmento de ADN de interés:

• Sistema β-gal: el vector codifica la enzima β-galactosidasa y en el interior de este gen está el polilinker; de esta manera el inserto de ADN interrumpe la expresión de β-galactosidasa y por lo tanto al crecer la bacteria en una placa con x-gal (el sustrato de dicha enzima que da un producto azul al hidrolizar) obtendremos colonias azules (-) sin inserto y colonias blancas (+) recombinantes.

Extracción de ADN Plasmídico

Gran variedad de métodos para el aislamiento de ADN plasmídico, en particular para aquellos plásmidos encontrados en Escherichia coli y otras enterobacterias.

Los métodos se diferencian en: pureza del producto final, tiempo necesario para llevarlos a cabo y en la posibilidad de aplicación en aislamiento a pequeña o gran escala.

Todos incluyen 3 etapas comunes: crecimiento de las bacterias y amplificación del plásmido, cosecha y lisis de las bacterias y purificación del ADN plasmídico.

La mayoría de los métodos explotan, de una u otra forma, las diferencias existentes entre el ADN cromosómico y el ADN plasmídico:

• Los plásmidos tienen un pequeño tamaño en relación con el cromosoma bacteriano.
• El ADN cromosómico de las bacterias es circular, pero al ser extraído la mayor parte se obtiene fragmentado, en moléculas lineales.
• Los plásmidos son moléculas de ADN circular, cerrado en forma covalente (CCC).

El procedimiento de desnaturalización alcalina, descripto por Birnboim & Doly, constituye la base de varios protocolos de extracción de ADN plasmídico.

Para la extracción de ADN plasmídico se lisan las células por el agregado de un detergente (ejemplo: SDS) y NaOH.

Las condiciones alcalinas (pH 12-12,5) desnaturalizan por completo las moléculas lineales de ADN, pero no las moléculas CCC (las cuales sufren una desnaturalización parcial).

El ADN cromosómico estará mayormente en forma fragmentada (múltiples moléculas lineales) y el plásmido, que en relación es más pequeño, se mantendrá cerrado.

Cuando el extracto celular es neutralizado (ejemplo con ácido acético) bajo condiciones de alta concentración salina (acetato de potasio), el ADN cromosómico precipita; obedece a la reasociación inespecífica de las largas cadenas de ADN de simple cadena, que ocurre en múltiples sitios formando una masa insoluble.

Parte del ARN precipita, pero siempre queda cantidad detectable de esta molécula, a menos que se utilicen RNasas durante el proceso de extracción.

También precipitan algunas proteínas debido a que la reacción se realiza en presencia de SDS y alta fuerza iónica, pero la extracción mayor de las proteínas se realiza posteriormente con cloroformo.

El ADN purificado se suele concentrar mediante precipitación alcohólica.

El cambio de polaridad del medio que genera el agregado de alcohol, y la disminución de la temperatura vuelven insoluble al ADN, pudiéndolo recuperar en un precipitado si es centrifugado a alta velocidad.

Protocolo es comúnmente utilizado para “minipreps” de ADN plasmídico, es decir, extracción a partir de un pequeño volumen (1-1,5 ml) de cultivo bacteriano saturado.

Cuanto más chico sea el plásmido, mejor es el resultado obtenido, ya que a medida que se incrementa el tamaño, sus propiedades se asemejan cada vez más a las del ADN cromosómico.

Con plásmidos mayores a 25 kb el aislamiento se hace dificultoso y el rendimiento es muy bajo.

Sin embargo, para los vectores de uso rutinario el rendimiento es muy bueno y el producto obtenido es lo suficientemente puro como para realizar digestiones con endonucleasas de restricción sin necesidad de una purificación ulterior.