Enzimas de restricción, Southern blot y técnicas moleculares: resumen de biología molecular

Introducción a la Preparación del ADN

• Si el ADN es circular o superenrollado (supercoil), dificulta determinar el tamaño correcto debido a que el ADN enrollado atraviesa con mayor facilidad los poros del gel.
• Lo que se debe hacer es digerir con una enzima que permita cortarlo y extenderlo (Circular $ ightarrow$ Lineal). Cuando está lineal, se puede determinar el tamaño correcto.
• Se sabe que es el tamaño correcto mediante un estándar de tamaño conocido (DNA ladder).

Enzimas de Restricción

• Se clasifican en 3 tipos, donde la mayoría pertenece al grupo II (proteínas monoméricas, poseen simetría rotacional y generalmente requieren $Mg^{2+}$).
• Son enzimas que reconocen secuencias específicas de ADN y cortan cuando reconocen estas secuencias.
• Son de origen bacteriano.
• Isosquímeros: Varias enzimas diferentes que reconocen la misma secuencia, donde algunas cortan la secuencia blanco en diferentes posiciones. Ejemplo: Sma I / Xma I
  • Sma I: CCC|GGG
  • Xma I: C|CCGGG
  • EcoR1: G|AATTC
• Secuencias metiladas:
  • A*: N6-metiladenina
  • C*: 5-metilcitosina
• HpaII y MspI reconocen la secuencia $CC^*GG$.
• Hpa II: No digiere ADN metilado.
• Msp I: Difiere entre metilado o no metilado.
• El 90% de las metilaciones en el genoma ocurren en 5-metilcitosina en $C^*G$.

Southern Blot

Esta técnica sirve para la identificación de secuencias.

Sonda: Ribonucleótido pequeño de hebra simple que se marca; esta se hibridará con la secuencia que se busca por complementariedad de bases. Si se pega a más bases de las necesarias, se lava con un tampón.

Pasos del Southern Blot

1. Extracción del ADN: Obtención del material genético de la muestra.
2. Digestión del ADN con una endonucleasa de restricción: El ADN extraído de la muestra se trata con una endonucleasa de restricción, que es una enzima que corta el ADN bicatenario en donde tenga una secuencia característica.
3. Electroforesis en gel de agarosa: Tras la digestión del ADN, los fragmentos de ADN resultantes se separan según su tamaño mediante electroforesis en geles de agarosa. Durante la electroforesis, las moléculas de ADN, que poseen carga negativa, migran hacia el electrodo positivo. Al avanzar, su velocidad de migración se ve reducida por la matriz del gel. Las moléculas menores se mueven más deprisa a través de los poros del gel que las de mayor tamaño. Como resultado, se produce una separación continua de los fragmentos de ADN de acuerdo con su tamaño, de modo que los fragmentos más pequeños avanzan la mayor distancia con referencia al origen o punto de aplicación de la muestra.
4. Preparación de un ensayo de Southern: Tras la electroforesis, las moléculas de ADN separadas se desnaturalizan mientras permanecen en el gel de agarosa, impregnando este con una disolución alcalina. Tras la neutralización de esta, el ADN monocatenario resultante se transfiere a la superficie de una membrana de nailon, realizando así una copia. Al igual que la aplicación de un secante a un papel con la tinta húmeda transfiere una réplica de la imagen, el "calco" del ADN del gel a la membrana de nailon conserva la distribución espacial de los fragmentos de ADN conseguida en el gel.
5. Hibridación con sonda radiactiva: Una sonda de locus único es una molécula pequeña de ADN o ARN capaz de hibridar con el ADN de un fragmento de restricción concreto. La formación de la molécula dicatenaria (dúplex) depende del emparejamiento de bases complementarias entre las secuencias de la sonda y del ADN presente en el "calco". Las sondas de locus único se marcan habitualmente con un isótopo radiactivo para facilitar su detección, y se eligen para que detecten un locus genético polimórfico en un solo cromosoma humano. El ensayo de Southern obtenido en la etapa 4 se incuba en una disolución que contiene una sonda radiactiva de locus único, bajo condiciones de temperatura y concentración de sales que favorezcan la hibridación. Tras producirse esta, se lava el exceso de sonda no unido, de modo que la única radiactividad que quede en la membrana de nailon sea la asociada al ADN del locus diana.
6. Detección de los RFLPs mediante autorradiografía: Las posiciones de hibridación de la sonda radiactiva sobre la membrana del ensayo de Southern se detectan mediante autorradiografía. La membrana de nailon se coloca, una vez lavada, junto a una película de rayos X dentro de una caja que las aísle de la luz. La película registra las posiciones donde hay desintegración radiactiva. Tras su exposición y el revelado fotográfico, el registro resultante se conoce como autorradiografía.
7. Reensayo del resultado del Southern con sondas adicionales: Se suelen caracterizar polimorfismos de ADN en varios cromosomas diferentes. Tras el revelado de una autorradiografía para la primera sonda, se puede lavar la radiactividad con una disolución a elevada temperatura, que deja el ADN en su sitio, e hibridarlo con una segunda sonda radiactiva que se una a un locus diferente. Se repiten así las etapas 5-7, detectando cada vez un locus diferente. El grupo de autorradiografías de una misma transferencia de Southern forma el "perfil de ADN".

Northern Blot

• 1. El procedimiento general comienza con la extracción del ARN total de una muestra de tejido homogéneo.
• 2. Las muestras de ARN son entonces separadas por electroforesis en gel.
• 3. Dada la fragilidad de los geles y la incapacidad de las sondas para penetrar en la matriz, las muestras de ARN, separadas por tamaño tras la electroforesis, serán transferidas a una membrana de nailon por medio de la capilaridad o un sistema de transferencia al vacío.
• 4. Los sistemas de capilaridad iónica se utilizan para transferir el ARN desde un gel de electroforesis a una membrana de Northern blot.
• 5. Después del marcaje de la sonda, esta se hibrida con el ARN en la membrana.
• 6. Finalmente, la membrana debe lavarse para asegurar que la sonda se ha unido de forma específica y para evitar ruido de fondo en las señales emitidas por la misma.

Comparativa Southern vs. Northern Blot

• Southern blot responde a:
  • Cuántas copias de un fragmento hay.
  • Cuantificar cantidad de exones e intrones.
  • Permite saber la ploidía de un fragmento.
  • Saber cuántos genes tiene un fragmento y si es polimórfico.
• Northern Blot: Se diferencia del Southern Blot en usar una solución de formaldehído/formamida que rompe su estructura secundaria. Permite detectar la presencia de un transcrito y proporciona información de su tamaño y procesamiento.

Ensayos de Protección

• Para saber la posición en la cromatina, ubicación y movimiento de nucleosomas durante los procesos de replicación y transcripción, así como la medición de los transcritos (cantidad).
• Solo se puede medir transcripción cuando se encuentra el gen y la ARN polimerasa en este. Se realiza mediante un ensayo de protección: cortar la secuencia del gen con enzimas de restricción y observar si esos trozos poseen la ARN polimerasa.
• Cuando está la polimerasa, si se digiere con otras enzimas, como la ADNasa, la zona donde se encuentra la polimerasa estará protegida y deberá quedar un espacio sin digerir.

DNA Fingerprinting

Técnica que se utiliza para ver si una especie es igual a otra, o si hay variantes génicas en una especie, generando bandas que permiten observar que existen diferencias.

• AFLP: Fragmentos de polimorfismo amplificado.
• RFLP: Longitud de fragmentos de restricción polimórficos.
• RAPD: ADN polimórfico amplificado al azar.
• DAF: Huellas dactilares de amplificación de ADN.
• SSCP: Polimorfismo conformacional de hebra única.
• Microsatélites.

PCR-RFLP

Metodología que combina la amplificación por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de una secuencia conocida (un locus) usando partidores específicos, seguida de la digestión del amplicón con enzimas de restricción que permiten cortar un fragmento amplificado en algunos individuos y en otros no, detectando así el polimorfismo.

Mapeo Cromosómico (FISH)

• Determinación de la localización y distancia entre genes de un cromosoma.
• Sirve para identificar en qué cromosoma está determinado gen.
• Marcaje de cromosomas mediante la hibridación con sondas fluorescentes.