¿Qué son las enzimas de restricción?

Son enzimas específicas de tipo II que reconocen una pequeña secuencia palindrómica de 4 a 8 nucleótidos en el ADN y cortan las dos hebras en ese lugar, generando fragmentos de restricción.

¿Qué es un ADN complementario (ADNc)?

Es un ADN sintetizado a partir de un ARNm maduro mediante la enzima transcriptasa inversa. Tras varios pasos se obtiene un ADNc de doble cadena.

¿Para qué sirve la PCR?

La reacción en cadena de la polimerasa permite amplificar, es decir, copiar miles de veces, una muestra muy pequeña de ADN.

Tecnología del ADN recombinante: enzimas de restricción, clonación y PCR

Resumen

El documento explica los fundamentos de la tecnología del ADN recombinante, desde las enzimas de restricción y la desnaturalización e hibridación de ácidos nucleicos hasta la síntesis de ADN complementario. También describe los vectores de clonación, los métodos de introducción del ADN recombinante, la identificación de clones con sondas, la PCR y la secuenciación por el método de Sanger.

Puntos clave

El ADN recombinante une fragmentos de ADN de distinta procedencia; su desarrollo se basó en el descubrimiento de las enzimas de restricción.
Las enzimas de restricción de tipo II reconocen secuencias palindrómicas de 4 a 8 nucleótidos y cortan las dos hebras, generando fragmentos de restricción.
La ADN ligasa convierte en permanentes las uniones temporales entre extremos complementarios.
El ADNc se sintetiza a partir de ARNm maduro mediante la transcriptasa inversa y se obtiene de doble cadena tras eliminar la horquilla.
Los vectores de clonación (plásmidos, bacteriófagos, cósmidos y cromosomas artificiales) transportan el ADN extraño y se replican en el hospedador.
La PCR amplifica miles de veces muestras muy pequeñas de ADN, y la secuenciación de Sanger usa didesoxirribonucleótidos que detienen la síntesis.

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Obtención de Fragmentos de ADN

Tecnología del ADN Recombinante

El ADN recombinante consiste en unir los fragmentos obtenidos con un ADN procedente de una fuente diferente o incluso de una especie distinta y lograr así una molécula de ADN. Se desarrolló gracias al descubrimiento de las enzimas de restricción.

Las enzimas específicas de tipo II reconocen en el ADN una pequeña secuencia de bases palindrómica determinada de entre 4-8 nucleótidos y el sitio de restricción para luego cortar las dos hebras de ADN por ese lugar. El corte es consecuencia de la hidrólisis del enlace fosfodiéster y genera dos fragmentos de ADN llamados fragmentos de restricción.

Los extremos de cada hebra de ADN están formados por bases complementarias que se pueden unir por enlaces de hidrógeno. Son temporales, pero pueden hacerse permanentes con la enzima ADN ligasa.

Renaturalización e Hibridación de Ácidos Nucleicos

Los ácidos nucleicos pueden sufrir desnaturalización por efecto de agentes químicos (como el pH elevado) o físicos (la temperatura), perdiendo su conformación tridimensional.

La hibridación está basada en la renaturalización de dos cadenas sencillas de ADN que se consigue al enfriar lentamente una disolución de ADN bicatenario previamente desnaturalizado por calor. Se pueden producir híbridos ADN-ADN, ARN-ARN y ADN-ARN.

Síntesis de un ADN Complementario (ADNc)

Se recurre a la enzima transcriptasa inversa. Su obtención sigue los siguientes pasos:

Se aísla y purifica un ARNm maduro.
Se añade un oligonucleótido de timina que se hibrida con la cola poli-A y funciona como cebador.
El ARNm actúa como molde para la síntesis de un ADNc de cadena sencilla.
Se añade NaOH que hidroliza el ARNm.
Se forma en el ADNc un lazo en horquilla que se convierte en cebador para que la ADN polimerasa I sintetice la segunda hebra de ADNc.
Se elimina la horquilla con una enzima específica y se obtiene ADNc de doble cadena.

Clonación Molecular

Para incorporar un gen a un fragmento de ADN que se quiere clonar en el hospedador, se emplean vectores de clonación, que son moléculas de ADN capaces de transportar ADN extraño y replicarse dentro del organismo hospedador.

Tipos de Vectores de Clonación

Plásmidos
Virus bacteriófagos
Cósmidos
Cromosomas artificiales

Métodos de Introducción de ADN Recombinante

Tratamiento con cloruro de calcio ($CaCl_2$): Las células se enfrían en resina de $CaCl_2$, se les da un choque por calor y las membranas celulares se hacen más permeables.
Electroporación: Una breve descarga eléctrica de alto voltaje causa la apertura de poros transitorios en la membrana por donde atraviesa el ADN recombinante.
Biolística: Las células son bombardeadas con microesferas recubiertas con el ADN recombinante.

Identificación de Clones Mediante Sondas

Las sondas son pequeños oligonucleótidos de cadena sencilla, formados por unos 20 nucleótidos, que se hibridan con cualquier ADN recombinante que tenga una secuencia de bases complementaria. Para poder rastrear la sonda, se marca radiactivamente o con una molécula fluorescente, lo que permite su posterior localización.

Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)

Es un tipo de clonación acelular que permite amplificar, es decir, copiar miles de veces una muestra muy pequeña de ADN.

Aplicaciones

Se puede amplificar y analizar muestras minúsculas de ADN de una diversidad de fuentes, así como analizar el ADN de las células de los embriones o el ADN de genomas virales difíciles de obtener.

Secuenciación del ADN

Se realiza por el método de Sanger (llamado de didesoxi), porque requiere la utilización de didesoxirribonucleótidos, que son nucleótidos modificados que han perdido su grupo -OH situado en el carbono 3'. Esto implica que la síntesis de ADN se detiene en ese nucleótido concreto.