Fundamentos y Proceso de Clonación Molecular

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Conceptos Clave en Clonación de ADN

Enzimas de Restricción

Reconocen una secuencia específica de nucleótidos (sitio de restricción) en una molécula de ADN de doble cadena y cortan por una secuencia palindrómica.

  • La enzima EcoRI proviene de Escherichia coli.
  • La enzima HindII proviene de Hemophilus influenzae.
  • Las endonucleasas de restricción de los tipos I y III no son útiles para la clonación de genes porque cortan el ADN en puntos distintos al de reconocimiento, es decir, realizan cortes aleatorios.
  • Las enzimas tipo II se usan ampliamente puesto que hacen cortes en sitios específicos.
  • Otras enzimas de restricción de tipo II, como SmaI, cortan el ADN formando fragmentos romos. Estos, primero deben modificarse mediante la enzima desoxinucleotidil transferasa terminal para adicionar “colas” de nucleótidos.

Condiciones para ser Utilizado como Vector

  • Tamaño pequeño (aproximadamente 3 kb).
  • Carecer del gen mob. La movilidad in vivo de un plásmido requiere del gen mob y del sitio nic.
  • Expresar marcadores fenotípicos o de selección.
  • Poseer secuencias de ADN que pueden ser sustituidas por ADN exógeno.
  • Llevar sitios de policlonaje (polilinker).

Tipos de Vectores

Plasmidios

  • Es una molécula de ADN circular, extracromosómica, que a menudo lleva información genética.
  • Se autorreplican.
  • Se encuentran en bacterias y levaduras.
  • Algunos codifican resistencia a antibióticos, a metales, producen toxinas, entre otros.
  • Reciben en promedio insertos de 5 kb.

Bacteriófagos o Fagos

  • Entre ellos el fago Lambda (λ).
  • ADN de doble cadena, lineal.
  • Tamaño de 48.5 kb.
  • Recibe tamaños de insertos de 18 a 25 kb.
  • Poseen sitios de reconocimiento donde se inserta el ADN exógeno.
  • El empaquetamiento se realiza in vitro. Fago λ + ADN foráneo.

Cósmido

Es un vector diseñado para permitir la clonación de segmentos largos de ADN foráneo. Los cósmidos son híbridos formados por sitios del fago lambda (bacteriófagos) insertados en plásmidos.

  • Plasmidio + secuencia cos del Fago λ = Cósmido.
  • Tamaño de 5 kb.
  • Creados para clonar fragmentos largos de ADN.
  • Recibe tamaño de insertos entre 40 y 45 kb.

Fragmento de ADN o ADN Foráneo

Es el ADN que se va a clonar, es decir, aislar, amplificar, secuenciar y expresar.

ADN Ligasa

Es la enzima que sella el hueco uniendo covalentemente las dos cadenas.

Célula Huésped

Es una bacteria, como Escherichia coli. Se utilizan como huésped ya que están bien caracterizadas genéticamente y pueden aceptar un amplio espectro de vectores (plásmidos, fagos y cósmidos).

Procedimiento de Clonación de ADN en E. coli

  1. Aislar el ADN que se va a clonar y tratarlo con una enzima de restricción para crear fragmentos que acaben en secuencias específicas.
  2. Ligar los fragmentos obtenidos a moléculas de plásmidos que han sido cortados con la misma enzima de restricción, obteniéndose un vector recombinante.
  3. Transferir el vector recombinante a células huésped bacterianas.
  4. Hacer crecer la célula huésped en una placa de cultivo donde formará colonias.

Experimento: Índice Mitótico en Allium cepa

Materiales

  • 12 Bulbos de Allium cepa.
  • 12 tubos de ensayo o pequeños vasos descartables.
  • Palitos mondadientes.
  • Agua mineral o agua hervida.
  • Solución de carbonato de calcio.
  • Solución de herbicida de paico y verdolaga.
  • Fármer (fijador).
  • Orceína lactoacética.
  • Una micropipeta.
  • Un bisturí o una guillette nueva.
  • Un mechero con ron de quemar.
  • Fósforos.
  • 04 frasquitos de penicilina.
  • Láminas portaobjetos y cubreobjetos.
  • Esmalte de uñas.
  • Papel filtro de grano grueso.

Procedimientos

  1. Cortar con un bisturí o guillette dos raicillas, tomar solamente la parte apical de 1 cm y añadir gotas de la solución de fijación (Fármer) hasta cubrirlas en el vial de penicilina. Fijar por 10 minutos.
  2. Eliminar el exceso de fijador con una pipeta y papel de filtro e inmediatamente añadir el colorante (Orceína acético-clorhídrica).
  3. Flamear hasta la emisión de vapores, evitando la ebullición.
  4. Dejar enfriar y repetir 2-3 veces durante 15 minutos.
  5. Sobre un portaobjetos cortar un fragmento apical de aproximadamente 3 milímetros al que se le añade una gota del colorante.
  6. Realizar el “squash” del tejido y sellar los bordes del cubre con barniz de uñas transparente para evitar la deshidratación celular.
  7. Observar a través de un microscopio óptico (usar cámara digital).
  8. Hacer la lectura de tres campos microscópicos por preparado.
  9. Calcular el índice mitótico (IM).

Índice Mitótico (IM)

Estima el porcentaje de células en división que existe en un tejido y, por lo tanto, es una medida del potencial proliferativo del mismo.