Tècniques de Manipulació d'ADN: Clonació i PCR

Cicle Vital dels Virus

El cicle vital dels virus comprèn les següents fases:

1. Entrada del virus a la cèl·lula hoste:
   • Adsorció específica: Reconeixement i unió de les proteïnes de la càpside amb receptors específics de la cèl·lula hoste.
   • Penetració: Pot ocórrer per injecció del virió, per processos d'endocitosi (on entra tot el virus) o per fusió de l'embolcall amb la membrana plasmàtica.
   • Descapsidació: Alliberament de l'àcid nucleic viral.
2. Replicació i síntesi dels components virals:
   • Síntesi de proteïnes del virus al citoplasma de la cèl·lula hoste.
   • Replicació de l'àcid nucleic viral al citoplasma o al nucli.
3. Maduració: Assemblatge dels components virals per formar nous virions.
4. Alliberament: Sortida dels virions de la cèl·lula hoste.

Tècniques de Manipulació de l'ADN

1. Seqüenciació de l'ADN

Les tècniques per conèixer la seqüència de nucleòtids de l'ADN van aparèixer a finals dels anys setanta. Actualment, es coneix la seqüència completa de milers de gens i el genoma complet de molts éssers vius, com ara diversos bacteris (E. coli), el llevat de la fermentació alcohòlica (Saccharomyces cerevisiae), la mosca Drosophila melanogaster i el genoma humà.

2. Formació de molècules d'ADN recombinat

S'anomena ADN recombinat les molècules d'ADN que resulten de la unió d'un gen escollit i un vector adequat per transportar-lo. Aquest procés comprèn les següents etapes:

1. Tall de fragments d'ADN: Els enzims de restricció tallen l'ADN només en certes seqüències de nucleòtids. Aquestes seqüències de reconeixement són curtes i palindròmiques. Els enzims de restricció tallen les dues cadenes en dos llocs diferents i originen extrems cohesius.
2. Separació de fragments d'ADN: En tallar l'ADN, s'originen fragments de diferents mides. Per separar-los, s'utilitza l'electroforesi en gel. Els fragments es desplacen pel gel depenent de la seva mida.
3. Unió al vector: Un cop obtinguts els fragments d'ADN, cal unir-los a molècules d'ADN transportadores, anomenades vectors. Aquests vectors solen ser plasmidis bacterians o genomes vírics d'ADN. La unió del gen aïllat al vector es fa mitjançant l'enzim ADN ligasa, formant molècules d'ADN recombinant.

Reacció en Cadena de la Polimerasa (PCR)

La PCR és una tècnica que permet obtenir moltes còpies d'un fragment d'ADN. Els enzims ADN polimerasa dupliquen l'ADN i copien les dues cadenes de la doble hèlix. Per a la PCR, es necessita:

• Una cadena motlle d'ADN.
• Una mescla de desoxiribonucleòtids trifosfat.
• Un encebador d'ARN.

La molècula o fragment d'ADN que es vol replicar es desnaturalitza per separar els brins de la doble hèlix mitjançant temperatures elevades. Cada un dels dos brins serveix com a motlle per sintetitzar una altra cadena complementària. És un procés exponencial, en el qual es duen a terme tants cicles com sigui necessari per obtenir el nombre de còpies desitjat. La PCR és un procés totalment automatitzat. Les ADN polimerases emprades procedeixen de bacteris termòfils, ja que aquests enzims són funcionals a temperatures elevades. Un cop amplificat, el fragment d'ADN es pot unir a qualsevol vector i introduir-lo en una cèl·lula hoste. La PCR té aplicacions en arqueologia, paleontologia, medicina forense, entre d'altres, ja que permet amplificar segments d'ADN presents en quantitats molt petites.

Clonació

La clonació és el procés de crear còpies idèntiques. Clonar un gen és obtenir un conjunt de nombroses còpies d'aquest gen. Hi ha tres tipus de clonació:

• Clonació molecular (copiar fragments d'ADN).
• Clonació cel·lular (copiar cèl·lules).
• Clonació d'organismes.

Clonació de Cèl·lules Bacterianes

La clonació de cèl·lules bacterianes comprèn les següents etapes:

1. Aïllament i obtenció del gen: Consisteix a tallar l'ADN cromosòmic en llocs concrets mitjançant enzims de restricció.
2. Selecció del vector de clonació: Són molècules petites d'ADN amb capacitat per autoreplicar-se. Tipus de vectors:
   • Plasmidis.
   • Genomes d'alguns virus.
   • Cromosomes bacterians artificials (plasmidis dissenyats per a la clonació).
3. Formació d'una molècula d'ADN recombinant.
4. Introducció a la cèl·lula hoste: Les cèl·lules hoste han de complir una sèrie de requisits:
   • Experimentar un creixement ràpid.
   • No ser perilloses o patògenes.
   • Ser capaces de captar molècules d'ADN del medi extern i incorporar-les.
   Mètodes per introduir ADN en cèl·lules vives (fenòmens parasexuals):
   • Transformació: En cèl·lules procariotes, la cèl·lula capta molècules d'ADN del medi extern, les introdueix i les incorpora al seu genoma.
   • Transducció: Consisteix a introduir l'ADN a la cèl·lula hoste utilitzant com a vector de clonació el genoma d'un virus bacteriòfag.
5. Comprovació de l'expressió del gen clonat i selecció de les cèl·lules hoste que el porten:
   • El vector de clonació pot portar gens marcadors, com ara gens de resistència a antibiòtics.
   • El gen es pot detectar mitjançant una sonda radioactiva, que és una cadena d'ADN complementària al gen d'interès.