Test de Ames, ribotipado y microarrays de ADN: técnicas moleculares en microbiología

Resumen

El texto describe tres técnicas moleculares usadas en microbiología: el test de Ames para evaluar la mutagenicidad de una sustancia, el ribotipado para identificar y clasificar bacterias a partir de sus genes de rRNA y los microarrays o chips de ADN para detectar microorganismos en una muestra. Se explican los fundamentos y los pasos de cada método.

Puntos clave

Test de Ames: se usan bacterias en un medio con poca histidina y la sustancia a estudiar; la mutagenicidad es proporcional al número de colonias tras 48 horas de incubación.
Ribotipado: identifica y clasifica bacterias por los patrones de bandas de DNA cromosómico digerido e hibridado con sondas de genes de rRNA.
Los genes de rRNA están en regiones muy conservadas del genoma; su número y localización varían según la especie, lo que hace único el ribotipo de cada especie.
El ribotipado incluye extracción y digestión del DNA, electroforesis, transferencia a membrana de nylon, hibridación, detección por luminiscencia y comparación con una base de datos.
Microarrays: sobre una superficie de vidrio o silicio se fijan secuencias de ADN de microorganismos; el ADN complementario de la muestra se une por hibridación y así se identifica el microorganismo.

Ponte a prueba

Test Ames

Las bacterias se extienden sobre una placa de agar con una pequeña cantidad de histidina y el compuesto químico cuyo efecto mutagénico se quiere comprobar. Esta pequeña cantidad de histidina en el medio de cultivo permite a las bacterias crecer por un tiempo inicial y tener la oportunidad de mutar. Cuando la histidina se agota, sólo las bacterias que hayan mutado para obtener la capacidad de producir su propia histidina van a sobrevivir y multiplicarse. En el experimento, la placa se incuba durante 48 horas, y la mutagenicidad de la sustancia será proporcional al número de colonias observadas en la placa.

Ribotipificación

El ribotipado es un método que permite identificar y clasificar bacterias en función de los genes del RNA ribosomal (rRNA). Los genes que codifican las moléculas de rRNA se encuentran dentro de las regiones mejor conservadas del genoma bacteriano. Existen varias copias de genes para el rRNA en cada célula y su número y localización específica en el cromosoma varían según las especies. Por tanto, los patrones de bandas del DNA cromosómico digerido e hibridado con sondas marcadas para los genes rRNA son específicos de cada cepa bacteriana, por lo que pueden ser utilizados para reflejar diferencias a nivel de especies y subespecies, es decir, para identificar y caracterizar bacterias al comparar dichos patrones con los obtenidos a partir de bacterias conocidas. El modelo de restricción, ribotipo, de una especie bacteriana particular es único.

La técnica del ribotipado consiste en los siguientes pasos:

Extracción y digestión del DNA con enzimas de restricción a partir de una colonia bacteriana en placa.
Separación mediante electroforesis de los fragmentos de DNA.
Transferencia de los fragmentos separados a una membrana de nylon.
Hibridación con una sonda del operón de rRNA de la bacteria marcada químicamente.
Adición de un conjugado enzima-anticuerpo que se une al marcaje de la sonda.
Detección de las bandas mediante luminiscencia.
Análisis y comparación de las bandas frente a una base de datos, lo que permite la caracterización y presunta identificación de la cepa bacteriana.

Microarrays o Chips de ADN

Consiste en colocar cientos o miles de secuencias de ADN de varios microorganismos sobre una superficie sólida de vidrio o silicio. Posteriormente, se deposita la muestra sobre la superficie. Si hay ADN complementario a cualquiera de las secuencias, se une por hibridación. El ADN no unido se puede eliminar por lavados y, después, se analiza para ver qué ADN se ha hibridado, pudiendo así identificar el microorganismo presente en la muestra.

Preguntas frecuentes

¿En qué consiste el test de Ames?

Es un ensayo en el que las bacterias se extienden en una placa con poca histidina y el compuesto a evaluar. Las bacterias que mutan y adquieren la capacidad de producir histidina sobreviven, y el número de colonias indica la mutagenicidad de la sustancia.

¿Para qué sirve el ribotipado?

Sirve para identificar y clasificar bacterias a nivel de especie y subespecie. Se comparan sus patrones de bandas de rRNA con los de bacterias conocidas almacenados en una base de datos.

¿Cómo funcionan los microarrays de ADN?

Se colocan cientos o miles de secuencias de ADN de microorganismos sobre una superficie sólida y se deposita la muestra. El ADN complementario se une por hibridación, y tras eliminar el no unido se analiza qué secuencias se han unido para identificar el microorganismo.