Técnicas de Hibridación de Ácidos Nucleicos: Detección y Aplicaciones

Hibridación de Ácidos Nucleicos

La hibridación de ácidos nucleicos se refiere a la unión de dos moléculas monocatenarias de ácidos nucleicos (ADN o ARN) por la complementariedad de sus secuencias de bases nitrogenadas, originando una molécula híbrida. Las técnicas de hibridación detectan secuencias concretas de ácidos nucleicos o dianas mediante el empleo de sondas marcadas.

Conceptos Clave

• Desnaturalización: Proceso por el cual dos cadenas de moléculas bicatenarias se separan por la ruptura de los puentes de hidrógeno.
• Renaturalización: Proceso por el cual dos cadenas de moléculas de ADN separadas por desnaturalización térmica se vuelven a unir hasta formar la doble hélice.
• Hibridación: Posee las mismas propiedades que una molécula bicatenaria de ADN en cuanto a desnaturalización y renaturalización. Las sondas usadas en la técnica se reconocen en regiones de ADN de secuencia única. La formación de este híbrido sigue una cinética de renaturalización de moléculas bicatenarias.

Sondas

Las sondas son fragmentos de ADN o ARN, que pueden ser bicatenarias o monocatenarias, utilizados para detectar la presencia de secuencias de ácidos nucleicos complementarias. Pueden variar en tamaño, desde pequeños oligonucleótidos hasta grandes fragmentos.

Características de las Sondas

• Especificidad: Capacidad que tiene una sonda para discriminar la secuencia diana con la que tiene que hibridar. Una sonda de 16 bases puede hibridar inespecíficamente con secuencias diana repetidas al azar por el genoma, imposibilitando la detección de la región de interés.
• Sensibilidad: Probabilidad de detectar cantidades mínimas de híbridos sonda/diana. Está relacionada con el número de moléculas marcadas que admite la sonda.

Fases de la Hibridación

1. Prehibridación
2. Hibridación
3. Detección del híbrido
4. Lavado post-hibridación

Técnicas de Hibridación

Dot Blot

El Dot Blot es una técnica de hibridación simple que utiliza membranas de nitrocelulosa o nailon como soporte sólido y detecta secuencias de ácidos nucleicos en una mezcla compleja sin aportar información adicional sobre su tamaño.

Protocolo Dot Blot

1. Preparación de la muestra de ADN y ARN
2. Prehibridación
3. Hibridación
4. Lavado post-hibridación
5. Detección del híbrido

Microarrays

Los microarrays son conjuntos de colecciones de fragmentos de ADN distintos fijados a una superficie sólida.

Protocolo Microarrays

1. Marcaje de la muestra (fluorocromo)
2. Hibridación en fase sólida y lavado post-hibridación
3. Lectura del microarray
4. Análisis de resultados

Técnica de Captura de Híbridos

Ejemplo: Protocolo para la detección del Virus del Papiloma Humano (VPH)

1. Lisar el virus y desnaturalizar el ADN.
2. Hibridar en tubo la muestra y mezclar con ADN.
3. Captura del híbrido: la mezcla se traspasa a un pocillo de la placa, se incuba y se lava.
4. Detección del híbrido: unión de anticuerpos anti ADN/ARN marcados con fluoróforos.
5. Revelado: añadir sustrato quimioluminiscente que emite señal.

Técnica de ADN Ramificado

1. Lisis de las partículas víricas y desnaturalización.
2. Hibridación con sondas específicas (sondas de captura y sondas de extensión).
3. Captura del híbrido.
4. Preamplificación.
5. Amplificación.
6. Detección.
7. Revelado.

Métodos de Marcaje de Sondas

• Desplazamiento de mella (Nick Translation): Para marcar sondas de gran tamaño, obtenidas por tecnologías de ADN recombinante.
• Cebado aleatorio (Random Priming): Para marcar sondas de ADN bicatenarias de gran tamaño o genomas completos con isótopos o haptenos.
• Marcaje terminal.