¿Por qué las muestras de sangre requieren un pretratamiento antes de la PCR?

Porque la mayoría de las células que contienen carecen de núcleo y la hemoglobina interfiere en técnicas como la PCR. Por ello se obtienen las células mononucleares mediante lisis de hematíes y separación.

¿Para qué sirve el EDTA en la solución de lisis?

El EDTA inactiva las ADNasas, enzimas que degradarían el ADN durante la extracción.

¿Qué tratamiento necesitan las muestras con pared celular?

Debe eliminarse esta capa mediante tratamiento enzimático con lisozima, tratamiento mecánico (ebullición o congelación y descongelación) o CTAB, que actúa sobre los polisacáridos de la pared.

Pretratamiento de muestras biológicas y extracción de ácidos nucleicos: protocolos

Resumen

El documento describe los protocolos de pretratamiento de distintos tipos de muestras biológicas (sangre, cultivos celulares, tejidos frescos y fijados en parafina, bacterias, levaduras, mucosa oral y esputo) para obtener células listas para su análisis. Explica también la composición de la solución de lisis, el tratamiento de muestras con pared celular y la verificación del resultado de la lisis.

Puntos clave

La sangre se trata para obtener células mononucleares (glóbulos blancos), mediante lisis de hematíes y separación con solución de separación en proporción 1:3.
Los cultivos celulares se recolectan según sean en suspensión o en monocapa, y se centrifugan, lavan y resuspenden.
La homogeneización puede ser mecánica (mortero, rejilla, equipos) o química (enzimas como detergentes o proteasas).
Los tejidos fijados en formol e incluidos en parafina se desparafinan con xilol y se rehidratan con alcoholes de graduación decreciente.
La solución de lisis contiene detergentes, EDTA, proteasas y agentes caotrópicos, cada uno con una función específica.
Las muestras con pared celular requieren tratamientos adicionales como lisozima, ebullición o congelación-descongelación, o CTAB.

Ponte a prueba

Pretratamiento de Muestras Biológicas

Las muestras de sangre son muy comunes debido a que son fáciles de obtener y no requieren el sacrificio del donante. Sin embargo, presentan dos inconvenientes:

La mayoría de las células que contienen carecen de núcleo.
La hemoglobina interfiere en varias técnicas como la PCR.

Las células objetivo del pretratamiento son las células mononucleares (glóbulos blancos). Su obtención se realiza en dos etapas:

1. Lisis de hematíes

Eliminación de los eritrocitos y sus componentes:

Mezclar la muestra con un anticoagulante (EDTA).
Lisis de los eritrocitos usando tampón de lisis.
Centrifugado.
Conservar el pellet (sedimento).
Lavado en tampón y resuspensión.

2. Separación de las células mononucleares

Mezcla en proporción 1:3 de muestra con solución de separación (por cada ml de muestra se añaden 3 de solución).
Centrifugación y conservación de la interfase.
Lavados sucesivos y resuspensión en tampón.

Cultivos Celulares Eucariotas

Su pretratamiento se llama recolección. Los cultivos pueden ser:

En suspensión: medio de cultivo líquido. Se usa el propio frasco tras centrifugar, lavar y resuspender la muestra.
En monocapa: medio de cultivo sólido.
- Se puede usar el propio frasco tras eliminar el medio de cultivo y centrifugar, lavar y resuspender.
- Pasar la monocapa a un tubo tras raspar y usar métodos químicos; en ambos casos centrifugar, lavar y resuspender.

Tejidos Animales y Vegetales Frescos

El pretratamiento se denomina homogeneización y puede realizarse:

De forma mecánica: automáticamente con equipos o manualmente en mortero o rejilla con tampón; a continuación, centrifugar, lavar y resuspender.
De forma química: empleando enzimas (detergentes o proteasas) que libren las células y, a continuación, centrifugar, lavar y resuspender.

Tejidos Fijados en Formol e Incluidos en Parafina

Pueden conservarse durante años, aunque los ácidos nucleicos se fragmentan en el proceso. Este pretratamiento se llama desparafinación y consta de los siguientes pasos:

Obtener láminas de 5-10 micras con el micrótomo.
Mezclamos las láminas con xilol y dejamos incubar.
Centrifugado.
Rehidratación progresiva con alcoholes de graduación decreciente y tampón en la resuspensión final.

Otras Muestras

Cultivos de Bacterias y Levaduras

En medios sólidos: se toma una parte y centrifugamos, lavamos y resuspendemos.
En medios líquidos: se pasan a un tubo con solución tampón empleando asa de siembra y centrifugamos, lavamos y resuspendemos.

Células de la Mucosa Oral

Se recolectan a partir de saliva o frotando el interior de la boca con un hisopo; a continuación, se mezcla con solución conservante y centrifugamos, lavamos y resuspendemos.

Esputo

Se mezcla con solución mucolítica y centrifugamos, lavamos y resuspendemos.

Extracción de los Ácidos Nucleicos

Se realiza mezclando la suspensión celular obtenida en el pretratamiento con solución de lisis y se deja incubar.

Componentes de la Solución de Lisis

Detergentes: atacan a lípidos, concretamente a los de las membranas.
EDTA: inactiva las ADNasas.
Proteasas: desnaturalizan las proteínas de membrana.
Agentes caotrópicos: inactivan las ARNasas.

Tratamientos de Muestras con Pared Celular

Debe eliminarse esta capa, por lo que se realizan procesos adicionales:

Tratamiento enzimático con lisozima.
Tratamiento mecánico: ebullición o congelación y descongelación.
CTAB: actúa sobre los polisacáridos de la pared celular.

Extracción Exclusiva de ADN

Se modifica la solución de lisis aumentando la cantidad de EDTA y sustituyendo a los agentes caotrópicos por ARNasas.

Verificación del Resultado de la Lisis

En este caso se realiza visualmente observando el lisado final, que debe ser homogéneo y sin grumos. En caso contrario, se repite la extracción aumentando el tiempo de incubación.