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Secuenciación, Hibridación y Regulación Génica: Conceptos Esenciales de Biología Molecular

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Fundamentos de la Biología Molecular

Métodos de Secuenciación de ADN

Método Químico de Maxam y Gilbert

Este método se basa en la modificación química específica de bases y la posterior ruptura de la cadena de ADN.

  • Dimetil Sulfato (DMS): Metila el N7, debilitando el enlace entre C8 y C9 de la Guanina.
  • Formato de Piperidina: Debilita el enlace glicosídico de las purinas con el azúcar.
  • Hidracina: Abre el anillo pirimidínico, el cual se cierra nuevamente en un anillo de 5. Si se utiliza en condiciones más alcalinas, solo actúa con la Citosina.

Método de Sanger (Secuenciación Dideoxi)

Se basa en la síntesis in vitro de ADN, utilizando didesoxinucleótidos (ddNTP) para detener la elongación de la cadena.

Componentes y Proceso
  1. ADN monocatenario (molde a ser secuenciado).
  2. Uso de didesoxinucleótidos trifosfatos (ddNTP).
  3. Partidor (primer) con marca radiactiva en el extremo 5'.
  4. ADN Polimerasa.
  5. La incorporación de ddNTP inhibe la polimerización y se generan fragmentos de diferente longitud.
  6. Resolución de fragmentos en geles de secuencia.
  7. Autorradiografía.
  8. Determinación de la secuencia mediante la lectura de los fragmentos de abajo hacia arriba.

Propiedades Físicas del ADN

Desnaturalización y Renaturalización del ADN

  • Desnaturalización del ADN: Separación de las dos hebras. Ocurre a pH > 13 o a temperaturas entre 90 - 100 ºC.
  • Renaturalización o Hibridación del ADN: Recuperación del estado de doble hebra. Ocurre típicamente entre 55 - 65 ºC.

Factores que Afectan la Estabilidad de la Hibridación entre Ácidos Nucleicos

  • Porcentaje de pares GC versus pares AT.
  • Grado de complementariedad entre hebras.
  • Largo de las hebras de polinucleótidos.
  • Concentración de sal en la solución de hibridación.
  • Temperatura de reacción.
  • Concentración de formamida en la solución de hibridación.

Sondas de Ácidos Nucleicos

Son hebras simples de ADN o ARN, que varían de 5 a más de 1000 nucleótidos, complementarias a secuencias específicas en el genoma. Para su diseño, es indispensable conocer la secuencia nucleotídica a la cual deben unirse.

Técnicas de Detección Molecular

Southern Blot: Identificación de Secuencias de ADN

Técnica de hibridación de ADN utilizada para:

  • Identificar una secuencia de ADN específica.
  • Determinar la ubicación de genes.
  • Identificación de organismos.
  • Caracterización molecular.
Procedimiento del Southern Blot
  1. Corte del ADN genómico con enzimas de restricción.
  2. Separación electroforética de fragmentos de ADN en gel de agarosa.
  3. Transferencia del ADN del gel hacia una membrana de nitrocelulosa o nylon.
  4. Hibridación mediante una sonda específica con marca radiactiva (ARN, ADNc, oligonucleótido).
  5. Autorradiografía.

Regulación de la Expresión Génica: El Modelo del Operón

Definiciones Clave del Operón

Operón
Unidad génica funcional policistrónica bacteriana. Incluye genes estructurales, una región promotora, una región operadora y un gen regulador.
Operón Inducible
Operón en el cual la presencia de una sustancia (inductor) promueve la transcripción de los genes estructurales.
Operón Represible
Operón cuya transcripción se suprime o bloquea en presencia de una molécula correpresora.
Promotor
Secuencia en el ADN a la cual se une la enzima ARN polimerasa antes de iniciar la transcripción.
Operador
Secuencia en el ADN donde se unen los represores.
Gen Estructural
Gen que codifica para una enzima de una vía metabólica.
Gen Regulador
Gen que codifica una proteína reguladora.
Represor
Proteína reguladora de expresión génica que, al unirse al ADN, inhibe la transcripción. Ejerce un control negativo.
Activador
Proteína reguladora de expresión génica que se une al ADN y promueve la transcripción. Ejerce un control positivo.
Inductor
Molécula que modifica al represor y así facilita la transcripción.
Expresión Constitutiva
Expresión génica constante sin mecanismo de regulación.

Componentes Enzimáticos del Operón lac

  • β-galactosidasa: Degrada la lactosa, formando glucosa y galactosa. También cataliza la isomerización de lactosa a alolactosa.
  • Lactosa Permeasa: Transporta la lactosa al interior de la célula.
  • Transacetilasa: Función no completamente conocida.

Tipos de Control de la Expresión Génica

  • Control Negativo: Mediado por el represor LAC I.
  • Control Positivo: Mediado por la proteína CAP.

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