Protocolo de hibridación in situ cromogénica (CISH) en tejidos: pasos clave

I. Desparafinado y rehidratación

El objetivo principal es eliminar la parafina y rehidratar el tejido. Para ello, se deben sumergir los portaobjetos con tejido en cubetas con disolventes orgánicos, como el xilol, y alcoholes de gradación decreciente hasta llegar a agua destilada o un tampón específico para rehidratar el tejido adecuadamente.

II. Digestión enzimática

Durante la fijación, el formol produce enlaces entre proteínas y otras macromoléculas. Este es un paso clave en la técnica de CISH, ya que el tratamiento enzimático libera a los ácidos nucleicos de su unión a histonas y otras proteínas, además de permeabilizar el tejido para que las sondas puedan acceder libremente a su secuencia diana. Las dos enzimas más utilizadas en este proceso son la proteinasa K y la pepsina.

III. Prehibridación

Su finalidad es el bloqueo de posibles uniones inespecíficas de la sonda. Este proceso se realiza inundando el tejido con una solución de prehibridación que contiene ADN de esperma de salmón fragmentado.

IV. Hibridación

Consiste en la condensación de la sonda y el ADN de la muestra. Se deposita sobre el tejido una pequeña cantidad de sonda y se coloca un cubreobjetos encima, evitando la formación de burbujas. Posteriormente, se coloca el portaobjetos en una placa calefactora a 95 ºC durante un periodo de 5 a 10 minutos. El tiempo de desnaturalización debe ser suficiente para que se separen las hebras de ADN sin que aparezcan burbujas ni se seque la sonda. Cabe destacar que el ARN con sondas de ARN no requiere este paso de desnaturalización. Finalmente, el portaobjetos se coloca en una cámara húmeda para evitar la desecación de la sonda y se incuba a la temperatura y el tiempo recomendados por el fabricante.

V. Lavado de posthibridación

Los portaobjetos se lavan por inmersión en soluciones de posthibridación colocadas en cubetas Coplin, siguiendo estrictamente los tiempos y las temperaturas indicadas por el fabricante.

VI. Detección del híbrido

Las sondas utilizadas en CISH se marcan con haptenos y se detectan mediante métodos inmunohistoquímicos indirectos. De la eficacia del método empleado en la detección dependerá directamente la sensibilidad de la técnica.

VII. Contratinción

En el tejido aparecen manchas coloreadas en las regiones donde se encuentra la secuencia diana. Sin embargo, el resto del tejido no es visible, lo que impide interpretar correctamente el resultado. Por este motivo, es necesario contrateñir el tejido con una tinción suave que permita la visualización de la morfología celular.

VIII. Visualización

Los resultados se visualizan con un microscopio óptico de luz transmitida. Dependiendo de las secuencias detectadas, la reacción coloreada se observará en el núcleo o en el citoplasma de las células que las contengan.