Prácticas de microbiología: coloraciones Gram, Ziehl-Neelsen, Leishman y medios de cultivo

Práctica 1: Microscopía

Pasos para la Coloración Simple

1. Extensión
2. Fijación
3. Coloración
4. Lavar, secar y observar

• En el microscopio de fluorescencia se ve el causante de sífilis (Treponema pallidum).
• El diafragma está en el condensador.

Práctica 2: Coloración Diferencial Gram

• El danés Christian Gram propuso investigar un colorante.
• Químicamente, la pared celular está representada por la mureína. Esta puede ser gruesa o delgada.
• 95% de mureína ocupada - 5% de ácidos teicoicos.
• 5% de mureína ocupada en bacterias, 95% de lipopolisacáridos (LPS).
• Colorante de contraste.
• Mordiente: función de adherir.

Se utilizan cuatro elementos:

• Cristal violeta: Colorante (Gram+: violeta) (Gram-: violeta)
• Lugol: Mordiente (Gram+: violeta) (Gram-: violeta)
• Alcohol acetona: Decolorante (Gram+: violeta) (Gram-: transparente)
• Safranina: Colorante (Gram+: violeta) (Gram-: rojo o rosado)
• Al juntar el cristal violeta con el lugol, el violeta aumenta de tamaño.
• En la mureína gruesa no sale el colorante y queda violeta.
• La safranina no pasa por toda esta réplica de cristal violeta: Gram+.
• La coloración Gram en la orina (infección urinaria) es causada por una Gram-, Escherichia coli (bacteria de color rojo).

Práctica 3: Coloración Diferencial de Ziehl-Neelsen

• El bacilo de Koch pertenece a la familia Mycobacterium. Es una bacteria Gram+ y es bacilo por su forma.
• Streptococcus, Bacillus.
• Dos alemanes crearon la coloración diferencial de Ziehl-Neelsen:
• Bacteriólogo: Franz Ziehl
• Patólogo: Friedrich Neelsen
• Hace resistente al Mycobacterium tuberculosis (persistente en el lugar) = Ácido micólico + (arabino galactano) + mureína.
• Es imposible detectar al bacilo de Koch mediante la coloración Gram.
• Principio: quimio al calor.
• Para el estudio se utiliza la muestra problema: espectoración.

Fucsina fenicada:

• BAAR: fucsia
• No BAAR: fucsia

Alcohol ácido:

• BAAR: fucsia
• No BAAR: incoloro

Azul de metileno:

• BAAR: fucsia
• No BAAR: azul

Práctica 4: Coloración Diferencial de Leishman y Vago

Coloración Leishman

• Microorganismos no pueden captar el colorante.
• Escocés: William Leishman (médico), hizo trabajos en la India contra el Kala-Azar.
• En Inglaterra observó en el hospital que en el bazo edematizado, empleó una combinación de dos colorantes: eosina y azul de metileno (AM). También utilizó alcohol metílico.
• Observando en las formas ovaladas en la autopsia de tendencia intracelular, eran responsables del Kala-Azar: parásito denominado Leishmania.
• Simultáneamente, había otro médico en la India, Francisco Donovan, que también encontró la estructura y se denominó: Leishmania donovani (intracelular).
• Giemsa: colorante que actualmente reemplaza a Leishman.
• Parásitos intracelulares que afectan los glóbulos rojos:
• La malaria, causante del paludismo.
• Enfermedad de Chagas (Trypanosoma cruzi) (tiene tendencia intracelular).
• Microorganismos que integran el término fusoespirilados: son conocidos como espiroquetas. Estas bacterias, debido a su forma y su contextura estructural, difícilmente se pueden teñir; su delgadez es extrema. Para poder colorearlas hay que tratar de engrosarlas.
• Esta bacteria principalmente se encuentra en el sarro dental.

Vago

• Vago ideó utilizar una sustancia conocida como reactivo (mercurocromo), que se va fijando sobre la superficie de la bacteria y la va a engrosar.
• La bacteria no tiene coloración y para poder observarla se utiliza violeta de genciana (recién la colorea).

Práctica 5: Medios de Cultivo

• Los microorganismos están por debajo de las 100 micras.
• Bacterias formando agrupaciones.
• El bacilo se está multiplicando.
• E. coli se está dividiendo cada 15 minutos.
• Estas bacterias están inhibidas (no cumplen función).
• A las bacterias se les da nutrientes para mantenerlas.

Medio de cultivo:

Son sustancias que pueden ser líquidas o sólidas y que contienen los nutrientes necesarios que los microorganismos necesitan para su función y fisiología.

Tipos de cultivo:

A) Por su origen:

• Naturales: no necesitan ningún elemento que se comporte como medio de cultivo.
  • Ejemplo: CO2, sangre, orina, heces fecales, lágrimas (lisozima antibacteriana).
• Artificiales: intervención con la mano del hombre. Pueden ser de dos tipos:
  • Semisintéticos: no se conoce su composición de manera exacta. Ejemplo: extracto de carne.
  • Sintéticos: ejemplo: agar nutritivo.

B) Por su aspecto físico:

• Líquidos: reciben la denominación de caldo. Ejemplo: caldo nutritivo.
• Sólidos: se les echa carbohidratos o almidón (degradado por las bacterias).
  • Ejemplo: agar sangre (sustancia extraída de algas teofitas).
  • Para solidificar un medio líquido se le adiciona agar-agar en una cantidad de 2 g por cada 100 ml (2 g%). Ejemplo: agar nutritivo.
• Semisólidos: se le adiciona agar en una cantidad de 5 g por cada 100 ml (5 g%). Sirve para transporte de muestras biológicas en el campo médico. Ejemplo: medio Cary-Blair.

C) Por su función:

• Medios comunes: permiten el crecimiento de cualquier bacteria Gram+ o Gram-. Ejemplo: caldo nutritivo o agar.
• Medios selectivos: permiten el crecimiento de un grupo de bacterias y no el de otras.
  • Ejemplo:
  • Agar manitol salado: permite el crecimiento de Gram+ (medio hipertónico).
  • Agar MacConkey: permite el crecimiento de Gram- (en su composición tiene sales biliares).

Dato: si se tiene la mureína delgada: débil (ejemplo: Gram-) y se tiene la mureína gruesa: resistente (ejemplo: Gram+).

• Medios diferenciales: permiten diferenciar bacterias del mismo grupo.
  • Se diferencian mediante la utilización de azúcares y otros no. Bioquímicamente hablando, utilizan azúcar.
  • Ejemplo clásico de azúcares es la lactosa.
  • En Gram-, un conjunto de bacterias no utiliza lactosa. Cuando la bacteria crece, lo hace con características diferentes.
  • Lactosa (-): es Salmonella.
  • Lactosa (+): es Escherichia coli.
• El mismo medio de cultivo que actúa como selectivo también se puede utilizar como diferencial.
• Van a crecer con características diferentes. Igual sucede con manitol, hay crecimiento de Gram+. Ejemplo:
  • Staphylococcus saprophyticus o epidermidis: no hace daño.
  • Staphylococcus aureus: hace daño (patógeno).
• Toda bacteria que metaboliza un azúcar a través de un proceso de fermentación:
• El destino final de un azúcar metabolizado por una bacteria es la producción de ácido láctico. Este ácido, si está presente: Staphylococcus aureus va a hacer que la coloración del medio de cultivo cambie a otro color. S. saprophyticus no cambia de color.
• Medios de cultivo de enriquecimiento:
  • Ejemplo: bacterias que se encuentran en la boca son: Streptococcus, Staphylococcus.
  • Si al agar nutritivo se le da sangre, se convierte en agar sangre (elemento vital para la función y metabolismo bacteriano es el factor de crecimiento).
  • Factor de crecimiento: elemento o sustancia que la bacteria requiere y no puede sintetizar.
  • Gonococo: es Gram- y requiere agar chocolate (el agar sangre se calienta y toma una coloración achocolatada) para crecer.
  • Agar Ogawa: mejor efecto en el bacilo de Koch.
• Medios de transporte:
  • Sirven para transportar. Ejemplo clásico: Cary-Blair (constituido por elementos inorgánicos, mantiene vivo pero no permite la reproducción).

D) Medios de cultivo líquidos: siempre van a estar en tubos de ensayo.

E) Medios de cultivo sólidos: en placas Petri o también en tubos de ensayo de posición inclinada o recta.

Práctica 6: Siembra y Medios de Aislamiento

Técnicas de siembra:

La forma principal para sembrar la bacteria es utilizar placas con medio de cultivo sólido.

• Agotamiento en superficie: estrías

Cuando se tiene la muestra problema en el hisopo y se tiene el medio de cultivo, con el hisopo se planta la muestra y, utilizando el asa de Kolle, se procederá a hacer estrías (la siembra es en la superficie, sin romper el medio).

• Otra forma en la cual la muestra se coloca en el medio y se hace estrías a los costados.
• Técnica francesa: se utiliza frecuentemente. Consiste en, con el asa flameada, comenzar a hacer estrías. Otra vez se flamea el asa y se hace otra estría. Se utiliza con muestras que son muy contaminadas, como materia fecal. El fin de hacer esta técnica es separar a las bacterias.
• La fase preliminar del cultivo microbiano bacteriano es el aislamiento.
• Luego de sembrada, se lleva a incubar a una temperatura corporal de 37 °C.
• Luego de 24 h se verá una colonia (es una representación macroscópica de una bacteria). Estas colonias se conocen como UFC (Unidad Formadora de Colonia).
• Las colonias más abundantes son las esféricas de centro claro.

En 1882, con la publicación de "Die Äthiologie der Tuberkulose", se comunica la aplicación de los postulados, que hoy van asociados a Koch:

1. El microorganismo (MO) debe estar presente en el individuo enfermo.
2. El MO debe aislarse del enfermo y mantener en cultivo puro.
3. La inoculación de este MO a una persona sana debe provocar la aparición de la misma enfermedad.
4. El MO debe ser reaislado de este enfermo.

• En un medio de cultivo líquido no se da colonia, y el crecimiento se va a ver por turbidez.

Práctica 7: Metabolismo Bacteriano

Qué es metabolismo:

• Es el conjunto de reacciones químicas que se producen en las células vivas microbianas.
• Es la transformación de nuevos nutrientes que se basa en el conjunto de catabolismo y anabolismo. Anabolismo (síntesis) <---> Catabolismo (destrucción).

Catabolismo:

Degradación de macromoléculas hasta moléculas simples, mediante la cual se genera energía representada en calorías.

Anabolismo:

Moléculas simples, posteriormente, van a ser utilizadas para construir otras macromoléculas. Implica gasto de energía.

Tres tipos de macromoléculas:

• Carbohidratos
• Proteínas
• Lípidos

Las bacterias utilizan glucosa (azúcar elemental) para usarla en diferentes medios:

Uno de ellos es utilizar el medio de cultivo sólido.

A) Medio TSI:

Se hace en un tubo en posición inclinada. Además, este medio contiene hierro.

• Los tres azúcares son:
  • Sacarosa: 0.1 g
  • Glucosa: 1.0 g
  • Lactosa: 1 g
• Normalmente, un azúcar degradado en ausencia de oxígeno (fermentación) es degradado, se va por la vía...
• Las bacterias, cuando hacen un proceso de fermentación, el producto final es ácido láctico.