Mutacions i enginyeria genètica: causes, tipus i reparació

1. Les mutacions

Són alteracions aleatòries del material genètic. Poden provocar deficiències i, en alguns casos, ser letals. Moltes mutacions són recessives i, per això, poden quedar amagades en un individu heterozigot. Tot i que sovint tenen un efecte negatiu per a l’individu, aporten variabilitat a la població i poden ser positives per a l’espècie a llarg termini. Si es produeix un canvi ambiental, l’existència d’individus mutants pot fer possible la supervivència d’algunes variants i, per tant, la persistència de l’espècie: això s’anomena selecció natural. Les mutacions permeten l’evolució de les espècies i la continuïtat de la vida.

Tipus segons la localització

Mutacions somàtiques: es produeixen en les cèl·lules somàtiques. Si no són viables, les cèl·lules poden ser substituïdes; si són viables, poden donar lloc a una colònia de cèl·lules mutants iguals a la primera.

Mutacions germinals: es produeixen en les cèl·lules reproductores i poden passar a la descendència.

Segons l'origen

Mutacions naturals: apareixen espontàniament.

Mutacions induïdes: provocades per radiacions, substàncies químiques o altres agents mutàgens.

Altres termes rellevants

Càrrega genètica d’efectes negatius: concepte que indica que, a cada generació, s’acumulen gens mutats amb efectes negatius en la població.

Mutacions genètiques: alteracions de la seqüència de nucleòtids d’un gen.

Mutacions cromosòmiques: alteracions de l’estructura d’un cromosoma (seqüència de gens).

Mutacions genòmiques: alteracions en el nombre de cromosomes.

2. Classificació de les mutacions gèniques

Mutacions per substitució de bases: canvis d’una base per una altra.

• Transicions: substitucions d’una purina per una altra (A↔G) o d’una pirimidina per una altra (C↔T).
• Transversions: substitucions d’una purina per una pirimidina o a la inversa.

Mutacions per pèrdua o inserció de nucleòtids: anomenades delecions o insercions. Produeixen un corriment del marc de lectura (frameshift) i alteren tots els triplets següents.

2.1 Causes de les mutacions gèniques

Errors de lectura: poden ocórrer durant la replicació de l’ADN, deguts a:

• Canvis tautomèrics: cada base nitrogenada es pot presentar en formes tautomèriques (normal i rara). Si un canvi tautomèric passa durant la replicació, pot causar aparellaments incorrectes i mutacions.
• Canvis de fase (slippage): lliscament del filament motlle durant la replicació; es formen bucles que, un cop aparellats, donen lloc a insercions o delecions i fixen la mutació.

Lesions fortuïtes: alteracions de l’estructura d’un o més nucleòtids que apareixen de manera natural.

• Despurinització: pèrdua de purines per ruptura de l’enllaç entre la base i la desoxiribosa.
• Desaminació: pèrdua de grups amino a les bases nitrogenades, que poden aparellar-se amb bases diferents de les normals.
• Dímer de timina: enllaç covalent entre dues timines contigües format per radiació UV.

Transposició: canvis de lloc espontanis de determinats segments d’ADN, anomenats elements transposables. Poden ser més petits que un gen (seqüències d’inserció), un gen o grups de gens (transposons).

2.2 Mutacions gèniques i sistemes de reparació

Correcció de prova (proofreading): redueix la probabilitat d’errors. L’ADN-polimerasa comprova el nucleòtid acabat d’incorporar; si és incorrecte, el retira i el substitueix.

Sistemes de reparació: revisen l’ADN acabat de sintetitzar i reparen lesions.

Reparació amb escissió d’ADN: s’inicia amb una endonucleasa que detecta l’error i produeix dos talls. Actua una exonucleasa que elimina els nucleòtids del segment tallat. L’ADN-pol I sintetitza el segment de forma correcta i finalment una ADN-ligasa uneix els extrems.

Reparació sense escissió de l’ADN: mecanismes directes de correcció de lesions (per exemple, reparació de dímeros de timina per fotoreactivació).

Sistema SOS: quan la duplicació queda paralitzada, un sistema enzimàtic (sistema SOS) permet continuar la síntesi evitant el bloqueig, però ho fa introduint bases de forma probable errònia. Això evita la parada de replicació però pot generar cèl·lules filles amb moltes mutacions.

3. Les mutacions cromosòmiques

S’originen canvis en l’estructura interna dels cromosomes.

Tipus de mutacions cromosòmiques

Deleció: pèrdua d’un fragment de cromosoma. Si conté molts gens, la deleció pot tenir conseqüències patològiques o ser letal.

Duplicació: repetició d’un segment d’un cromosoma. Pot estar en el mateix cromosoma, haver-se unit a un no homòleg o haver-se independitzat. Pot augmentar el material genètic i, mitjançant mutacions, afavorir l’aparició de nous gens durant l’evolució.

Inversió: canvi de sentit d’un fragment del cromosoma. Inversió pericèntrica si el centròmer està inclòs; paracèntrica si no ho està. Pot causar problemes en els descendents si durant la meiosi es produeixen creuaments dins de la regió invertida.

Translocació: canvi de posició d’un segment cromosòmic. Translocació recíproca: intercanvi entre cromosomes; translocació no recíproca: migració d’un segment sense intercanvi. Poden afectar la descendència, que pot heretar cromosomes incomplets o amb duplicacions.

4. Les mutacions genòmiques

Aneuploïdia: alteració en el nombre normal d’exemplars d’un o més tipus de cromosomes. Poden ser nul·lisomies, monosomies, trisomies, tetrasomies, dobles trisomies, etc., quan en lloc de dos cromosomes per parell n’hi ha cap, un, tres, quatre, etc.

Fusió cèntrica: unió de dos cromosomes no homòlegs amb pèrdua d’un centròmer.

Fissió cèntrica: escissió d’un cromosoma en dos fragments; pot donar lloc a nous centròmers.

Segregació errònia durant la meiosi: distribució incorrecta de les cromàtides homòlogues entre les cèl·lules filles durant la meiosi; en una cèl·lula poden anar les dues cromàtides i l’altra quedar-se sense.

Euploïdia: alteració en el nombre normal de dotacions haploides d’un individu.

Monoploïdia: un sol exemplar de cada tipus de cromosoma.

Poliploïdia: més de dos exemplars de cada tipus de cromosoma (triploïdies, tetraploïdies, etc.).

• Autopoliploïdies: tots els jocs cromosòmics procedeixen de la mateixa espècie.
• Al·lopoliploïdies: procedents de la hibridació entre dues espècies diferents.

5. Els agents mutàgens

Agents físics

• Radiacions no ionitzants (UV): els raigs ultraviolats són radiacions que l’ADN absorbeix fàcilment. Poden provocar l’aparició d’enllaços covalents entre dues pirimidines contigües (per exemple, dímeros de timina) i formes tautomèriques que condueixen a mutacions gèniques.
• Radiacions ionitzants: radiacions amb més energia que els UV. Poden provocar la pèrdua d’electrons en alguns àtoms de l’ADN, trencament dels anells de les bases nitrogenades i ruptures dels enllaços fosfodièster, amb la consegüent ruptura de l’ADN i dels cromosomes.

Agents químics: substàncies que reaccionen amb l’ADN i poden modificar les bases o intercalar-se entre parells de bases.

• Modificacions de bases nitrogenades.
• Substitució per bases anàlogues: substitució d’una base per una altra anàloga que pot generar aparellaments incorrectes.
• Intercalants: molècules similars a un parell de bases que s’insereixen entre els parells de bases. Poden provocar insercions o delecions d’un parell de bases durant la replicació.

6. L’evolució del concepte de gen

Un gen és un segment d’ADN o d’ARN amb informació per a una cadena polipeptídica o per a un ARN funcional. En eucariotes, els gens acostumen a presentar exons separats per introns.

Gens sobreposats: en alguns virus, una mateixa seqüència de nucleòtids pot contenir dos gens segons el marc de lectura utilitzat (per exemple, si es comença a llegir pel primer o pel segon nucleòtid).

7. L’ADN dels organismes eucariotes

En procariotes, l’ADN conté una còpia de cada gen, sovint sense introns, i hi ha poc ADN no transcrit. En eucariotes hi ha molt més ADN: al voltant del 10% del genoma són gens, i els introns poden augmentar la longitud de la seqüència codificant diverses vegades. Hi ha seqüències repetides de diferents tipus.

ADN altament repetitiu: representa aproximadament un 10% del total. Constituït per seqüències curtes (5–10 parells de bases) repetides en tandem moltes vegades (fins a 10^6–10^8 repeticions). Són situades als extrems i a les constriccions dels cromosomes i tenen principalment una funció mecànica.

ADN moderadament repetitiu: al voltant del 20% del total. Format per seqüències de 300–5.600 pb, amb còpies variables (entre 10 i >1000). Inclou gens que codifiquen histones, ARNr, ARNt i altres seqüències amb funció coneguda o desconeguda.

ADN no repetitiu: uns 70% del total. Conté la major part de la informació que passa a ARNm i dóna lloc a proteïnes; també inclou ADN espaiador que no es transcriu. Hi ha gens de còpia única i gens duplicats que presenten petites variacions i poden donar lloc a proteïnes diferents. També hi ha pseudogens: seqüències inservibles que no es transcriuen.

Moltes seqüències tenen el seu origen en elements transposables, segments capaços de desplaçar-se dins del genoma i multiplicar-se dins de l’ADN de la cèl·lula hoste; sovint se’ls considera «ADN egoista» per la seva capacitat d’escapar a la selecció.

Alguns procariotes poden fabricar gens sobreposats a partir d’una mateixa seqüència d’ADN; en eucariotes, seqüències diferents acostumen a donar lloc a un sol producte proteic després de la maduració del pre-ARNm.

8. L’enginyeria genètica

Tècnica que permet la modificació del genoma d’un individu. El genoma és el conjunt haploide de gens d’un organisme (es considera una còpia de cada tipus de gen).

La modificació del genoma es pot fer per addició, eliminació o alteració de gens. L’ADN obtingut s’anomena ADN recombinant. És possible gràcies als enzims de restricció, que permeten tallar l’ADN en punts concrets per aïllar un gen d’interès (ADN passatger) i introduir-lo en un vector adequat (plasmidi bacterià o virus). Quan les cèl·lules que han rebut un gen es reprodueixen, parlem de clonació.

8.1 Formes d’introducció de gens en cèl·lules

Plasmidis: un plasmidi bacterià és un petit ADN circular de doble hèlix que es pot trobar en diversos exemplars dins d’un bacteri i es duplica de forma autònoma. Transformació: si es produeix lisi bacteriana i l’ADN plasmídic queda lliure al medi, pot ser incorporat per altres bacteris.

Bacteris receptors: adquireixen les propietats dels gens presents al plasmidi. Als plasmidis vectors s’hi afegeixen sovint gens que codifiquen resistència a antibiòtics per facilitar la selecció dels bacteris que han integrat el plasmidi.

Plasmidis i eucariotes: els plasmidis bacterians no solen servir per introduir gens en cèl·lules eucariotes animals; altres vectors o mètodes s’utilitzen per a aquest fi (per exemple, vectors virals o tècniques no biològiques).

Certs bacteris (p. ex. Agrobacterium) contenen un T-DNA que s’ha utilitzat com a vector per introduir gens en plantes; també es poden utilitzar llevats com a hostes eucariotes.

Virus: s’utilitzen com a vectors. Quan un virus infecta un bacteri en el cicle lític, pot destruir l’ADN cel·lular i empaquetar segments d’ADN víric i, ocasionalment, fragments d’ADN hoste (transducció). En el cas de vectors vírics, sovint s’eliminen els gens responsables de la lisi perquè el vector només serveixi per transferir i expressar el gen d’interès a mesura que la cèl·lula es divideix.

Transducció: procés d’intercanvi de material genètic dut a terme per bacteriòfags que actuen com a agents transmissors.

Transformació: absorció de fragments d’ADN lliure per part d’un bacteri, que pot integrar-los o expressar-los.

Mecanismes no biològics: electroporació, microinjecció i tret de microbales.

• Electroporació: sotmetre les cèl·lules a un camp elèctric d’alta intensitat durant un temps breu; això pot generar permeabilitats temporals a la membrana plasmàtica que faciliten l’entrada d’ADN extern.
• Microinjecció: injecció directa d’ADN a la cèl·lula mitjançant un capil·lar.
• Tret de microbales (biobalística): delimitació d’una pistola que dispara microbales de metall recobertes d’ADN per introduir material genètic en cèl·lules.

8.2 Inserció de gens

Per inserir el DNA passatger en un vector cal tallar amb el mateix enzim de restricció ambdues molècules. Aquests enzims solen reconèixer seqüències palindròmiques i deixen extrems cohesius (o extrems plans). Els extrems cohesius són complementaris i faciliten la formació d’ADN recombinant. L’ADN-ligasa uneix finalment els extrems per crear unions permanents.

En procariotes no hi ha processos de maduració de l’ARNm; per tant, per expressar un gen eucariòtic en bacteris cal utilitzar una còpia d’ADN sense introns (ADNc) obtinguda, per exemple, per transcripció inversa.

Transcriptasa inversa: produeix ADN complementari (ADNc) a partir d’un ARNm madur, que després es pot duplicar i introduir en un vector per ser expressat en bacteris. Alguns virus d’ARN de cadena positiva poden sintetitzar ADN quan entren a la cèl·lula.

Aquest procés permet que un bacteri pugui fabricar proteïnes pròpies d’eucariotes mitjançant l’ús d’ADNc lliure d’introns.

8.3 Selecció del clon

Només una part de les cèl·lules serà transformada pel vector adequat; no tots els vectors tindran la seqüència d’interès. Cal seleccionar les cèl·lules que contenen l’ADN recombinant.

Un mètode clàssic utilitza un plasmidi amb el gen ampR (resistència a ampicil·lina) i el gen lacZ (que codifica la beta-galactosidasa). Dins del gen lacZ hi ha el lloc de restricció on s’insereix el fragment d’interès.

1. Tallar els plasmidis i l’ADN d’interès amb el mateix enzim de restricció per generar extrems cohesius.
2. Mesclar fragments d’ADN amb els plasmidis tallats perquè s’uneixin per complementarietat i afegir ADN-ligasa per formar unions permanents.
3. Transformar bacteris mutats en lacZ amb aquests plasmidis; alguns incorporaran plasmidis recombinants.
4. Sembrar els bacteris en un medi amb nutrients, ampicil·lina i X-gal. Només els bacteris amb plasmidis (ampR) sobreviuran; les colònies amb plasmidis no recombinants (lacZ funcional) seran blaves, i les colònies amb plasmidis recombinants (lacZ interromput per inserció) seran blanques.

Per identificar la colònia amb el gen d’interès se sol utilitzar una hibridació amb una sona d’àcid nucleic complementària a una part coneguda de la seqüència, marcada amb un isòtop o un marcador detectable.

8.4 La reacció en cadena de la polimerasa (PCR)

La PCR s’inicia amb l’ADN que conté la seqüència diana, una ADN-polimerasa termoestable, els quatre desoxiribonucleòtids trifosfat i dos primers (oligonucleòtids) complementaris als extrems de la seqüència diana. La mescla s’escalfa (per exemple, ~95 °C) per separar les dues cadenes d’ADN. Després, en una fase de repòs a menor temperatura, els primers s’hibriden amb les cadenes separades i l’ADN-polimerasa sintetitza la cadena complementària. Cada cicle duplica aproximadament la quantitat de producte; després de n cicles s’obté teòricament 2^n còpies. Per exemple, al cap de 20 cicles s’obtenen prop d’un milió de còpies.

9. Enginyeria genètica i teràpia de malalties humanes

Teràpia de la cèl·lula somàtica: la modificació afecta només determinades cèl·lules somàtiques i no les cèl·lules germinals, de manera que el canvi no és hereditari.

Teràpia de la línia germinal: totes les cèl·lules de l’individu serien modificades i aquests canvis serien heretables i podrien transmetre’s a les generacions futures.

9.1 Producció de substàncies humanes per enginyeria genètica

Insulina: molècula que regula el nivell de glucosa en sang. Té dues cadenes d’aminoàcids (cadena A i cadena B). Les seqüències nucleotídiques corresponents s’introdueixen en plasmidis i s’expressen en bacteris per separat. Després de purificar les cadenes i activar els grups —SH, s’unien per formar la insulina humana madura.

Hormona del creixement: proteïna d’un sol polipèptid de 191 aminoàcids; el seu gen s’ha introduït en bacteris i s’utilitza per tractar casos de nanisme.

Interferó (IFN): proteïna produïda per cèl·lules en resposta a infeccions víriques. S’ha utilitzat en algunes malalties víriques i, en aplicacions concretes, té efectes antitumorals.

Factor VIII: la manca d’aquest factor provoca hemofília; la introducció del gen humà en bacteris ha permès produir aquest factor de manera més rendible que l’obtenció a partir de plasma humà.

9.2 Introducció de gens en cèl·lules humanes

Deficiència d’adenosina-desaminasa (ADA): malaltia greu del sistema immunitari que afecta limfòcits; els infants afectats han de viure en entorns protegits. El tractament experimental inclou inserir l’ARN del gen correcte en un retrovirus, infectar cèl·lules del pacient i injectar-les de nou a la medul·la òssia.

1. Inserció de l’ARN del gen correcte en el retrovirus.
2. El retrovirus infecta les cèl·lules del pacient.
3. Injecció de les cèl·lules modificades a la mèdul·la òssia.

Talassèmia: grup de malalties causades per alteracions en els gens de l’hemoglobina que provoquen anèmia de gravetat variable. El tractament experimental consisteix a extreure cèl·lules de la medul·la òssia, introduir-hi el gen correcte mitjançant un retrovirus i reinfundir-les en el pacient perquè es reimplantin a la medul·la òssia.

9.3 Obtenció de vacunes recombinants

Consisteix a produir vacunes sense el patogen complet: s’expressa i purifica una o diverses proteïnes antigèniques (antígens) que desencadenen la resposta immunitària sense provocar la malaltia.

Exemple: la proteïna de l’hepatitis B es pot clonar en un plasmidi i expressar-la en llevats. La proteïna recombinada, amb la glicosilació adequada quan és necessari, s’utilitza com a vacuna segura i eficaç.

10. Aplicacions agrícoles i animals

10.1 Enginyeria genètica aplicada a la producció agrícola

Varietats transgèniques del blat de moro: poden resistir gelades mitjançant la incorporació d’un gen d’una espècie de peix resistent al fred; poden resistir plagues o herbicides gràcies a gens específics.

Tomàquet transgènic: madura més lentament perquè el gen que regula la maduració s’ha inserit en sentit invers i ha quedat inactivat.

Plantes de tabac transgèniques: si s’introdueix el gen de la luciferasa, algunes parts de la planta poden arribar a emetre llum en presència de luciferina.

Arròs transgènic (Golden Rice): conté un alt contingut en beta-carotè, precursor de la vitamina A.

10.2 Enginyeria genètica aplicada a la producció animal

Moltes aplicacions en animals aquàtics, ja que la fecundació externa facilita la introducció de gens al zigot (mitjançant microinjecció o electroporació).

Carpes transgèniques: poden créixer més ràpidament gràcies a la introducció d’un gen de l’hormona del creixement d’altres espècies, sovint regulat per promotors que permeten el control de l’expressió.

Salmons transgènics: poden resistir millor temperatures baixes gràcies a gens d’espècies adaptades al fred.

En mamífers, es pot extreure cèl·lules mare embrionàries (per exemple de blastocist), introduir-hi el gen d’interès, seleccionar cèl·lules transformades, reinserir-les en blastocists i obtenir animals quimèrics que, en creuar-se, poden donar descendència transgènica.

11. El càncer: una malaltia genètica

11.1 Concepte i relació amb l'ADN

El càncer consisteix en la multiplicació accelerada de certes cèl·lules alterades que formen tumors i poden disseminar-se a altres òrgans mitjançant la sang o el sistema limfàtic (metàstasi). Un tumor benigne sol estar localitzat i no infiltra altres teixits; un tumor maligne creix invasivament i pot destruir teixits propers.

Les cèl·lules canceroses es divideixen ràpidament, tenen proteïnes de membrana diferents, alteracions morfològiques i tendència a envair teixits propers. Factors ambientals que danyen l’ADN poden induir transformacions canceroses.

Proto-oncogens: gens normals que, amb petites alteracions, poden convertir-se en oncogens i provocar transformació cancerosa. Antioncogens (gens supressors de tumors) inhibeixen la divisió cel·lular. L’equilibri entre aquests tipus de gens és clau per al control del creixement cel·lular.

11.2 Càncer produït per virus

Virus oncogènics: contenen gens capaces d’induir transformació cancerosa (oncogens).

Exemples: el virus del sarcoma de Rous va ser fonamental per al descobriment de l’enzim retrotranscriptasa. El virus del papil·loma humà (HPV) pot provocar berrugues genitals i està implicat en el càncer d’úter (càncer cervical) en dones.

11.3 Càncer i substàncies químiques

La majoria dels càncers no són directament causats per virus, sinó per agents cancerígens com radiacions UV, radiacions X i diverses substàncies químiques. Molts agents cancerígens són també mutàgens.

L’aparició del càncer sol requerir exposicions repetides i factors promotors addicionals. La transformació maligna pot implicar la col·locació d’un oncogen sota el control d’un promotor potent (major expressió), així com la pèrdua de funció del sistema immunitari o alteracions en la resposta de limfòcits T citotòxics i la síntesi d’interferó.