Microscòpia: Lents, Tipus, Tècniques i Preparació de Mostres

Lents i Microscopis: Una Introducció

Lents convergents/convexes: més gruixudes al centre que a les vores. Els raigs de llum, en travessar-les, convergeixen en un sol punt. Amplien els objectes.

Lents divergents/còncaves: més gruixudes a les vores que al centre. Els raigs divergeixen en travessar-les. Redueixen la mida dels objectes.

Components i Característiques del Microscopi

Microscopi

Combinació de dues lents convergents: objectiu + ocular.

Elements de la Lent

• Centre òptic: centre de la lent.
• Distància focal: distància del focus al centre.
• Focus: punt focal davant i darrere del centre.
• Centre de curvatura: davant i darrere del focus.
• Eix principal.

Característiques Òptiques del Microscopi

• Augment: quantitat de vegades que el microscopi amplia la mostra.
• Contrast: absorció diferent de la llum entre la mostra i el medi.
• Poder de resolució: capacitat d'una lent per revelar els màxims detalls de la mostra. Com més resolució, més separats es veuen els punts.

Factors que Afecten el Poder de Resolució

Depèn de:

• La longitud d'ona (λ).
• L'angle d'obertura (ON).
• L'índex de refracció (n).

PR = 0,61 x (longitud d'ona / ON)

ON = Índex de refracció x sin de l'angle.

Índex de refracció de l'oli: 1,56; aire: 1.

n = velocitat de la llum al buit / velocitat de la llum al medi.

Obertura Numèrica

Quantitat de raigs refractats per la mostra que recull l'objectiu. L'obertura dels objectius humits és d'1,25 perquè es dispersa menys que els secs (0,65).

Altres Característiques

• Longitud mecànica del tub: distància de separació entre objectiu i ocular.
• Distància frontal: distància entre objectiu i mostra.
• Nombre de camp: diàmetre del camp de visió observable a través d'un ocular.
• Camp real d'observació: l'àrea que es veu amb el microscopi.
• Profunditat de focus: el gruix de la imatge de la mostra que apareix enfocada per l'objectiu.
• Condensador: concentra els raigs al centre de la mostra.
• Regulació de la llum: regulador electrònic o diafragma.

Neteja de Lents

• Submergir en alcohol 90% i àcid clorhídric (proporció 9:1). Rentar amb aigua i assecar amb drap de cotó.
• Mescla sulfocròmica amb dicromat de potassi, àcid sulfúric i aigua destil·lada.

Si hi ha restes d'oli: preparació d'aigua destil·lada + xilol i deixar 24 hores. Rentar amb aigua i sabó, passar a aigua destil·lada. Si són nets, assecar; si no, guardar amb alcohol de 70º-96º.

Tipus de Microscopis Òptics

Microscopi de Camp Llumínic

El més utilitzat en laboratoris d'anatomia patològica. Emet llum visible, condicionant el poder de resolució. Per augmentar el contrast, es tenyeix o es passen filtres.

Microscopi de Camp Fosc

La mostra es veu blanca i brillant, i la resta fosca. S'aconsegueix posant un filtre a la font de llum. Manifesta la forma, la mida i el moviment de les cèl·lules. S'utilitza per observar microorganismes aquàtics, cèl·lules de cultiu, microorganismes mòbils i observar la mitosi.

Tècnica d'Il·luminació Rheinberg

Tècnica de camp fosc amb filtres de colors. Només per a objectius de baix o mitjà augment.

Microscopi de Contrast de Fases

Utilitza un filtre que no deixa passar els raigs centrals, il·luminant la mostra lateralment. Les ones electromagnètiques xoquen amb la foscor. Es canvia el condensador i l'objectiu. Els objectius porten gravat en verd Ph1.

Microscopis de Fluorescència

Tipus de Microscopis de Fluorescència

• Fluorescència de llum transmesa.
• Fluorescència de llum incident: més utilitzat, incorpora un mirall dicroic i un filtre de reflexió de l'ona ultraviolada. Concentra millor la radiació fluorescent que surt de la mostra.

Microscòpia Confocal

La font de llum és un làser, il·luminant la mostra amb radiació monocroma d'alta intensitat i estable. Ofereix imatges de millor qualitat i permet imatges 3D. Porta més filtres per seleccionar la longitud d'ona d'emissió del fluorocrom. La imatge és captada per fotodetectors sensibles a la fluorescència.

Aplicacions de la Microscòpia de Fluorescència

S'usa per a l'estudi de cèl·lules normals i patològiques. En estudis d'immunofluorescència, permet identificar microorganismes i anticossos. Es basa en l'ús d'anticossos units o marcats amb fluorocroms.

Immunofluorescència Directa i Indirecta

• IFD (Directa): per identificar la presència de microorganismes. Cal fixar la mostra i afegir l'anticòs específic marcat amb fluorocrom.
• IFI (Indirecta): per identificar anticossos. S'afegeix l'anticòs específic, i després un segon anticòs que s'uneix al primer, marcat amb fluorocrom.

Fluorocroms i Microscòpia de Fluorescència

S'utilitzen microscopis amb alta sensibilitat per millorar el poder de resolució. S'afegeixen fluorocroms, molècules que absorbeixen llum ultraviolada i emeten llum visible. Deixen d'emetre llum quan arriben al seu estat normal.

Tipus de Fluorocroms

• Fluoresceïna.
• Rodamina.

Per marcar la mostra, s'utilitza la tècnica d'immunofluorescència. La font de llum són làmpades de mercuri, filtres, objectius amb gran capacitat de transmissió de llum, alta qualitat d'imatge, elevada obertura numèrica i baix poder de resolució. El filtre d'excitació canvia la longitud d'ona. El filtre barrera i el mirall dicroic eliminen la reflexió d'ona ultraviolada. Els fluorocroms es poden combinar per visualitzar diferents parts de la cèl·lula, especialment durant la divisió cel·lular.

Microscopis de Camp Ultraviolat

La longitud d'ona es troba entre 380 i 400 nanòmetres. El poder de resolució és de 0,1. No la capta l'ull, s'ha d'observar en pantalla. La font de llum són làmpades de mercuri o xenó. Porten filtres de diferents colors segons la longitud d'ona. Els objectius són de quars o fluorita perquè el vidre no deixa passar la UV. Tenen miralls que desvien la llum. Les imatges són semblants a les de fluorescència. Les estructures es veuen brillants i la resta fosques. S'usa en ciència forense per a l'ADN i en laboratoris de genètica.

Microscòpia Electrònica

Usa feixos d'electrons en lloc de fotons, disminuint la longitud d'ona i augmentant el poder de resolució. La longitud d'ona disminueix aplicant voltatges intensos. Utilitza lents electromagnètiques en lloc de vidre o quars. Els feixos s'aconsegueixen escalfant un filament de tungstè, que desprèn electrons. Hi ha imants abans i després de la mostra per aconseguir un feix. El feix es condueix fins a la placa detectora. Per augmentar, s'augmenta el voltatge, concentrant el feix.

Tipus de Microscòpia Electrònica

• MET (Microscòpia Electrònica de Transmissió): el feix travessa la mostra, que ha de ser molt prima perquè els electrons tenen poc poder de penetració. Es fixa la mostra amb OsO4, es deshidrata amb alcohol de menys a més concentració, s'inclou, es fan talls ultrafins, i la mostra es posa sobre una reixeta de coure. Les imatges són en blanc i negre. No es poden veure microorganismes vius. S'usa en biologia i medicina.
• MER (Microscòpia Electrònica de Rastreig): el feix no travessa la mostra, només passa per la superfície. La mostra es recobreix amb un metall conductor (or). El detector està al voltant de la mostra perquè el feix no la travessa, permetent imatges 3D. Té menys poder de resolució. Es fixa la mostra, es deshidrata amb CO2 i s'asseca, no es talla, es millora el contrast banyant en or o grafit, i s'observa. S'usa en biologia i medicina, i medicina forense.

Bomba de Buit

Necessària perquè els electrons es dispersarien en l'aire.

Tincions

No es tenyeixen perquè la difracció és variable.

Observació Vital i Preparació de Mostres

Observació Vital

Permet veure microorganismes vius.

Preparacions Humides

Es fan amb microscopi compost o de contrast de fases. Les preparacions s'obtenen de material clínic fresc o cultius en plaques de Petri. Les mostres poden ser sediments urinaris (mostra d'orina centrifugada), esputs o exsudats.

Procediment

• Si la mostra és líquida: posar la mostra al portaobjectes i cobrir amb un cobreobjectes.
• Si la mostra és sòlida: preparar un tub d'assaig amb solució salina i col·locar el microorganisme sembrat en una placa de Petri. Col·locar una gota del preparat al portaobjectes i cobrir amb un cobreobjectes. Observar amb 4x, 10x i 40x.

Examen de Gota Pendent

S'utilitzen portaobjectes especials amb excavacions. Se segella amb parafina entre el porta i el cobreobjectes si és necessari.

Examen amb Fresc de Nigrosina

S'utilitza per observar flagels i càpsules.

Procediment

• Posar 1-2 gotes de nigrosina al portaobjectes i 1-2 gotes de la mostra.
• Barrejar les gotes de mostra amb nigrosina.
• Deixar assecar a temperatura ambient.
• Observar amb objectiu 100X (oli d'immersió). El fons queda tenyit de negre i el que es vol observar d'un color diferent (ex: blanc).

Coloracions Vitals

Coloracions de matèria viva. S'utilitzen a baixes concentracions (1/1000 o 1/10000).

Exemples

• Blau de metilè.
• Roig neutre.
• Verd Janus.

L'objectiu és observar cèl·lules que quedaran tenyides però no moriran.

Tincions

Segons l'Aplicació

• Tinció simple: un colorant.
• Tinció diferencial: més d'un colorant (ex: tinció de Gram).
• Tinció estructural: més d'un colorant per posar de manifest estructures bacterianes (ex: flagels, càpsules).
• Tincions especials: tinció negativa o de fluorescència.

Segons el Procediment

• Tècnica d'immersió: típica d'hematologia. Permet tenyir diverses parts de la mostra alhora.
• Tècnica de vessament: la més utilitzada. Consisteix a fer lliscar el colorant sobre la mostra amb un comptagotes.

Factors que Influeixen en la Tinció

• Puresa dels colorants i reactius.
• Concentració del colorant.
• pH de la solució del colorant.
• Temperatura.
• Substàncies addicionals.
• Temps de tinció.

Colorants

Naturals

• Vegetals: safranina, orceïna, clorofil·la, hematoxilina.
• Animals: carmí.

Artificials

• Àcids (citoplasmàtics): eosina, àcid pícric, fucsina àcida.
• Indiferents (lípids): Sudan III.
• Neutres (compostos colorant àcid + base): May-Grünwald, Giemsa, Wright.
• Bàsics (nuclears).

Acció dels Colorants

• Acció progressiva: com més temps, més color (tionina, blau de toluidina, blau de metilè).
• Acció regressiva: sobretinció i decoloració fins al punt òptim (fucsina bàsica).

Propietats dels Colorants

• Mordent: líquid que ajuda a la tinció (ex: lugol).
• Maduració: alguns colorants necessiten hores o dies per dissoldre els cristalls i tenyir bé (ex: hematoxilina).
• Viratge: canvi de color en rentar la preparació (ex: hematoxilina rentada amb aigua).
• Metacromàsia: un mateix colorant tenyeix diferents estructures de color diferent.

Tipus de Tincions

Tincions Simples

Utilitzen un colorant per observar la morfologia cel·lular (ex: blau de metilè).

Tincions Diferencials

Utilitzen més d'un colorant per posar de manifest característiques de la cèl·lula (ex: tinció de Gram).

Tinció de Gram

• Gram +: blau.
• Gram -: rosat.

Procediment

1. Fer extensió de la mostra. Assecar a temperatura ambient. Fixar amb Bunsen.
2. Tenyir amb cristall violeta (5 min).
3. Rentar amb aigua.
4. Cobrir amb lugol (1 min).
5. Rentar amb aigua.
6. Decolorar amb alcohol-acetona (20 segons, 3 vegades).
7. Rentar amb aigua.
8. Tenyir amb safranina (30 segons).
9. Rentar amb aigua.
10. Assecar amb paper.
11. Observar a 40x, 100x, 400x per enfocar i a 1000x amb oli.

Tincions Estructurals

Utilitzen més d'un colorant per posar de manifest estructures cel·lulars (espores, flagels, càpsules).

Procediment

1. Portaobjectes amb mostra.
2. Posar gotes de colorant (esperar temps de tinció).
3. Rentar l'excés de colorant.
4. Assecar a temperatura ambient.
5. Observar a 4x, 10x i 100x (oli).

Procés d'Obtenció de Fotografies Digitals Microscòpiques

1. Observar una preparació de forma convencional amb el microscopi.
2. Capturar la imatge microscòpica.
3. Processar la imatge digital per millorar la qualitat.
4. Arxivar la preparació digital en un format adequat.
5. Recuperar, transmetre i compartir les preparacions arxivades.

Microscòpia Digital

Consisteix en la descomposició de la imatge en una matriu de punts amb un valor proporcional a la lluminositat.

Fórmula

Mida impressió (polzada) = número de píxels / resolució

1 polzada = 25,4 mm

Sistemes de Color

• RGB: usat en dispositius amb pantalla (suma de llum vermella, verda i blava).
• CMYK: usat en impressores (cian, magenta, groc i negre).

Formats de Compressió d'Imatges

• JPEG: molt usat, imatges reals amb molts colors, però amb pèrdua de qualitat.
• TIFF: bona qualitat, arxiu gran, usat per imprimir.
• RAW: imatge real, sense pèrdua d'informació, arxiu gran.

Formats de Vídeo

• AVI: format estàndard per guardar vídeos digitals.
• MPEG: format estàndard per compressió de vídeo digital.
• FLV: format d'Adobe Flash per visualitzar vídeo a Internet.