Radioinmunoensayo RIA e IRMA: métodos, detectores y curva patrón

Fundamentos y Técnicas de Radioinmunoensayo (RIA e IRMA)

Radioinmunoensayo Competitivo (RIA Competitivo)

1. Sensibilización del soporte sólido con un Anticuerpo (Ac) específico para un Antígeno (Ag) problema.
2. Adición de un Ag problema (muestra) y del mismo Ag marcado con un isótopo radiactivo.
3. Competición de ambos Ag por unirse al Ac del soporte: cuanto mayor sea la concentración del Ag problema, menor será la concentración del Ag marcado que se una.
4. Formación del complejo Ag-Ac.
5. Lavado de la muestra.
6. Medición de la radiactividad del soporte sólido.

Ensayo Inmunorradiométrico Competitivo (IRMA Competitivo)

1. Sensibilización del soporte sólido con Antígeno (Ag) de cantidad conocida.
2. Adición del Ag problema de la muestra y del Anticuerpo (Ac) marcado.
3. Competencia entre el Ag del soporte sólido y el Ag de la muestra problema por el Ac marcado.
4. Lavado de la muestra.
5. Medición de la radiactividad del soporte sólido.

Ensayo Inmunorradiométrico No Competitivo (IRMA No Competitivo o Técnica Sándwich)

Nota: La medición de la radiactividad del soporte sólido puede proceder de complejos Ag-Ac-Antiinmunoglobulina.

1. Sensibilización del soporte sólido con un Anticuerpo (Ac1) añadido en exceso.
2. Adición del Antígeno (Ag) problema de la muestra.
3. Formación del complejo Ag-Ac.
4. Adición en exceso de un segundo Anticuerpo (Ac2) marcado con un isótopo radiactivo.
5. Formación del complejo Ac1-Ag-Ac2 (o "sándwich").
6. Lavado de la muestra, eliminando los Ac sobrantes.
7. Medición de la radiactividad del soporte sólido.

Métodos de Partición y Criterios de Separación

Los métodos de partición, utilizados para separar la fracción libre y ligada, deben cumplir los siguientes requisitos:

1. Conseguir una completa separación de la fracción libre y ligada.
2. No verse influenciado por las diversas sustancias presentes en la reacción.
3. Ser reproducible, económico (barato) y técnicamente rápido.
4. No interferir en la reacción Antígeno-Anticuerpo (Ag-Ac).

Instrumentación: Detectores de Centelleo

Detectores de Centelleo Sólido (Gamma)

El material fluorescente utilizado es un cristal de yoduro de sodio activado con talio (NaI(Tl)).

Cuando la radiación incide en el cristal, se produce un efecto fotoeléctrico que provoca que el talio emita fluorescencia, generando fotones luminosos. Estos fotones son recogidos por un fotocátodo, creando una señal eléctrica medible que, en último término, permite obtener la información necesaria.

Detectores de Centelleo Líquido

Para la medición de una muestra radiactiva, se prepara una disolución de la misma en un disolvente apropiado y se añaden uno o varios líquidos centelleadores (denominados fluoróforos primario y secundario). Esta mezcla se conoce como cóctel de contaje o cóctel de centelleo, y se introduce en un recipiente llamado vial de contaje.

El proceso de detección sigue la siguiente secuencia:

1. La energía de la radiación emitida por la muestra es captada por el disolvente.
2. El disolvente emite un fotón de luz, que es captado por el fluoróforo primario.
3. El fluoróforo primario emite un segundo fotón de luz (de distinta longitud de onda), que es recogido por el fluoróforo secundario.
4. El fluoróforo secundario emite, por último, un fotón de luz con una longitud de onda sensible al fotocátodo del detector.
5. Estos fotones generan una señal eléctrica medible que proporciona la información necesaria.

La Curva Patrón: Cuantificación de Resultados

Para poder relacionar los valores de radiactividad obtenidos con la concentración de la muestra problema, es fundamental construir una curva patrón que establezca esta relación paramétrica.

El proceso implica relacionar los resultados de las mediciones de radiactividad obtenidas con los diferentes patrones o estándares con sus concentraciones conocidas y reales. Esto permite generar una gráfica que representa la relación matemática existente entre:

• Variable Dependiente: Concentración.
• Variable Independiente: Radiactividad.

Mediante la curva patrón, los resultados obtenidos en la medición de la radiactividad se relacionan y de ahí se puede extrapolar la concentración de la muestra problema que se desea cuantificar.

Ventajas de los Sistemas de Medición

Los sistemas de medición de radiactividad en inmunoensayos ofrecen las siguientes ventajas clave:

• Rapidez
• Sensibilidad
• Automatización