Fundamentos y Metodologías de la Transformación Genética en Plantas

Fundamentos de la Transformación Genética

La secuencia de terminación indica a la maquinaria celular que se ha alcanzado el final de la secuencia génica. Asimismo, se agrega un gen marcador seleccionable al "constructo" génico con el fin de identificar las células o tejidos de la planta que han integrado con éxito el transgen.

Metodologías de Transformación

Sistemas de transferencia indirectos (vectores biológicos)

• Sistemas basados en Agrobacterium tumefaciens: Utilizan el plásmido Ti.
• Sistemas basados en Agrobacterium rhizogenes: Utilizan el plásmido Ri.
• Sistemas basados en virus vegetales: Virus del mosaico de la coliflor, virus del mosaico del tabaco y virus X de la papa.

Sistemas de transferencia directa de ADN

• Microinyección: Inserción directa en la célula.
• Electroporación: Mediada por cationes divalentes y pulsos eléctricos.
• Biobalística: Método de la "pistola génica".

Transformación de Plantas

Se define como el cambio heredable en una célula u organismo, producido por la absorción y establecimiento del ADN introducido.

El Método de Agrobacterium

Esta técnica se practica con éxito tanto en dicotiledóneas como en monocotiledóneas. Es preferible a la pistola de genes debido a que presenta una mayor frecuencia de inserciones en un solo sitio del ADN extraño, lo cual facilita la vigilancia.

Agrobacterium tumefaciens

Esta bacteria "transforma" la planta mediante:

• Genes para la síntesis de hormonas vegetales: Auxinas y citocininas (causan el tumor o crecimiento descontrolado).
• Genes para la síntesis de opinas: Utilizadas como fuente de alimento por la bacteria.

A. tumefaciens vive en el suelo e infecta las células vegetales a través de lesiones, causando agallas de la corona en ornamentales y frutales. El plásmido Ti (inductor de tumores) contiene:

• ADN-T (transferido): Fragmento que se transfiere a la célula vegetal durante la infección.
• Genes vir (virulencia): Dirigen el proceso de infección.

Para su uso como vector, los científicos han eliminado la sección de ADN-T inductora de tumores, conservando las regiones fronterizas y los genes vir.

Mapa del Plásmido Ti

• ADN-T: Región transferida.
• Genes vir: Implicados en la ruptura del ADN-T y activación de otros genes.
• Origen de replicación (ori).
• Genes tra: Responsables de la transferencia por conjugación.

Mecanismo de Infección

La bacteria infecta a través de lesiones. Los genes vir cumplen funciones críticas:

• Copian el ADN-T.
• Unen un producto a la hebra para que actúe como líder.
• Agregan proteínas de protección al ADN-T.
• Abren un canal en la membrana bacteriana para el paso del ADN-T.

Se hipotetiza que el ADN-T se inserta en el ADN de la planta durante la replicación o transcripción.

Otras Técnicas de Transformación

• Transformación de tabaco: Mediante Agrobacterium tumefaciens.
• Microinyección.
• Transferencia por biobalística: Utiliza una pistola génica con micropartículas de oro o tungsteno y una membrana transportadora.

Selección y Regeneración

Selección de tejidos transformados

Tras la inserción, los tejidos se transfieren a un medio selectivo con herbicida. Solo las plantas que expresan el gen marcador sobrevivirán.

Regeneración de plantas completas

A partir de tejidos transgénicos (como embriones inmaduros), se cultivan en condiciones controladas con nutrimentos y hormonas. Tras la producción de semillas, comienza la evaluación de la progenie.

Análisis de Plantas Transgénicas

Las técnicas utilizadas incluyen:

• PCR, RT-PCR y qRT-PCR.
• Northern Blot (análisis de ARN).
• Southern Blot (análisis de ADN).
• Western Blot (análisis de proteínas).