Fundamentos Esenciales de Microbiología: Microscopía, Tinciones y Pruebas Bioquímicas Clave (TSI, Citrato, LIA, MIO)

Componentes del Microscopio Óptico

• Lente Ocular
• Tubo Óptico (Cañón)
• Lentes de Objetivos
• Revólver
• Tornillo Macrométrico
• Tornillo Micrométrico
• Platina
• Condensador

Técnicas de Tinción Fundamentales

Tinción de Gram

Procedimiento secuencial para la diferenciación bacteriana:

1. Cristal Violeta (1 min), lavar.
2. Lugol (1 min), lavar.
3. Alcohol-Acetona (decoloración) y lavar.
4. Safranina (1 min), lavar.
5. Flamear (secado).

Tinción con Tinta China

Método utilizado para visualizar cápsulas bacterianas o levaduras:

1. Colocar una gota de tinta china en el borde del portaobjetos.
2. Sostener el portaobjetos con el pulgar y el índice.
3. Usar otro portaobjetos en diagonal, sostenido con el pulgar y el índice.
4. Deslizar el segundo portaobjetos hacia atrás hasta tocar la gota y luego deslizarlo hacia adelante para crear una capa uniforme.
5. Flamear (fijación).

Pruebas Bioquímicas para Identificación Bacteriana

Las siguientes pruebas son esenciales para la caracterización metabólica de microorganismos, especialmente Enterobacterias.

TSI (Triple Sugar Iron Agar)

El medio TSI se utiliza para determinar la capacidad de un organismo para fermentar tres azúcares (glucosa, lactosa y sacarosa) y para producir ácido sulfhídrico (H₂S).

Composición del Medio TSI

• Medio inclinado de color inicial rojo.
• Estado: Sólido.
• pH: 7.3 ± 0.2
• Peptona de caseína: 10 g
• Peptona de carne: 10 g
• NaCl: 5 g
• Lactosa: 10 g
• Sacarosa: 10 g
• Dextrosa: 1 g
• Sulfato de hierro y amonio: 0.2 g
• Tiosulfato de sodio: 0.2 g
• Rojo de fenol: 0.25 g
• Agar: 13 g

CIT (Citrato de Simmons)

Esta prueba determina si un organismo es capaz de utilizar citrato como única fuente de carbono y compuestos amoniacales como única fuente de nitrógeno en su metabolismo, provocando una alcalinización del medio.

Entre las enterobacterias, estas características se dan en los siguientes géneros: Enterobacter, Klebsiella, Serratia, Citrobacter y algunas especies de Salmonella. Sin embargo, Escherichia, Shigella, Salmonella typhi y Salmonella paratyphi son incapaces de crecer con esos nutrientes.

Se cultiva el microorganismo en agar citrato de Simmons. Este medio contiene citrato de sodio y fosfato de amonio como fuentes de carbono y de nitrógeno, respectivamente, y azul de bromotimol como indicador de pH. Solo las bacterias capaces de metabolizar el citrato podrán multiplicarse en este medio y liberarán iones amonio, lo que, junto con la eliminación del citrato (ácido), generará una fuerte basificación del medio que será aparente por un cambio de color del indicador de pH, de verde a azul.

Composición del Medio CIT

• Utilización del citrato.
• Medio inclinado de color verde.
• Estado: Sólido.
• pH: 6.9 ± 0.2
• Fosfato dihidrogenado de amonio: 1.00 g
• Fosfato dipotásico: 1.00 g
• NaCl: 5.00 g
• Citrato de sodio: 2.00 g
• MgSO₄: 0.20 g
• Agar: 15.00 g
• Azul de bromofenol: 0.08 g

LIA (Lysine Iron Agar)

El medio LIA se utiliza para detectar la descarboxilación o desaminación de la lisina y la producción de ácido sulfhídrico (H₂S).

Composición del Medio LIA

• Lisina y arginina.
• Medio inclinado de color violeta.
• Estado: Sólido.
• pH: 6.7 ± 0.2
• Peptona de gelatina: 5 g
• Extracto de levadura: 3 g
• Dextrosa: 1 g
• L-Lisina: 10 g
• Citrato de hierro y amonio: 0.5 g
• Tiosulfato de sodio: 0.04 g
• Púrpura de bromocresol: 0.02 g
• Agar: 13.5 g

MIO (Movilidad, Indol, Ornitina)

Esta prueba bioquímica permite identificar bacterias de acuerdo a su motilidad, a la reacción de Indol y a la descarboxilación de la ornitina.

Composición del Medio MIO

• Movilidad, indol, ornitina.
• Medio plano de color púrpura.
• Estado: Semisólido.
• pH: 6.5 ± 0.2
• Extracto de levadura: 3.0 g
• Peptona de gelatina: 10.0 g
• Peptona de caseína: 10.0 g
• L-Ornitina: 5.0 g
• Dextrosa: 1 g
• Agar: 2 g
• Púrpura de bromocresol: 0.02 g