Fluorimetría: principios, preparación de muestras y aplicaciones en espectroscopía

Fluorimetría: Especie atómica (átomos/iones en la matriz de la muestra)

Principio físico: espectroscopía de emisión tras absorción de radiación.

Especie

Átomos e iones en la matriz de la muestra.

Fundamento

Átomos en estado fundamental en una nube atómica son capaces de absorber radiación (visible/UV) y emitir a continuación radiación de la misma o similar longitud de onda.

Identificación

Se hace pasar a través de la nube atómica radiación de longitud de onda correspondiente a una línea del espectro de absorción del átomo absorbente. Los átomos presentes en la nube atómica pasan del estado electrónico fundamental a un estado excitado. Los átomos excitados se relajan y pasan del estado excitado al estado fundamental emitiendo la misma longitud de onda perteneciente a su espectro de emisión.

Cuantificación

A mayor emisión, mayor concentración de átomos en la nube atómica y, por tanto, mayor concentración del analito en la muestra original.

Preparación de la muestra y comportamiento

Los analitos suelen encontrarse de forma ionizada y hay que transformarlos en átomos. Existen dos posibilidades; a continuación se describe la opción para muestras gaseosas o líquidas:

1) Muestras gaseosas o líquidas — Sistema de llama (sistema de medida continuo)

• Aspiración por un capilar hasta el nebulizador.
• Nebulización: transformar la muestra en un aerosol.
• Cámara de premezcla: se mezcla el aerosol con el combustible y con el comburente; el aerosol se enfrenta a una serie de deflectores que reducen el tamaño de gota que llega a la llama.
• En la llama producida por una chispa:
  • Desolvatación: secado rápido del líquido que contiene el analito (por ejemplo, suero).
  • Volatización: cambio de estado de líquido a estado gaseoso.
  • Atomatización: ruptura de los enlaces del analito con otros átomos, transformándose en átomo elemental, que es la especie absorbente. Se debe evitar que se excite o se ionice, porque no absorberá.

Secuencia de componentes

Fuente monocromática → llama → monocromador → detector.

Aplicaciones

Zn, Hg, Se.

Fluorimetría: Especie molecular (moléculas)

Principio físico: espectroscopía de emisión tras absorción de radiación.

Especie

Moléculas.

Fundamento

Moléculas capaces de absorber radiación (visible/UV), excitarse a un estado electrónico superior y relajarse emitiendo radiación de longitud de onda igual o inferior a la absorbida en una cubeta.

Identificación

Se hace pasar a través de la cubeta radiación de longitud de onda correspondiente a una banda del espectro de absorción de la molécula absorbente.

Cuantificación

Las moléculas absorbentes presentes en la cubeta pasan del estado electrónico fundamental a un estado excitado; las moléculas excitadas se relajan y pasan del estado excitado al estado fundamental emitiendo una longitud de onda igual o menor a la absorbida y perteneciente a su espectro de emisión. A mayor emisión, mayor concentración de la molécula; esta se relaciona con el analito por su presencia en una reacción química.

Preparación de la muestra y comportamiento

Los analitos más comunes no suelen ser fluorescentes ni fosforescentes, por lo que se pueden hacer dos preparaciones. A continuación se describe la preparación mediante reacción química:

1) Mediante reacción química

• Derivatización: se hace reaccionar una alícuota de la muestra con reactivos específicos para obtener un producto que emita radiación de fluorescencia. El producto se coloca en la cubeta.
• Fluoroinmunoanálisis: el analito (por ejemplo, una proteína) reacciona con un anticuerpo marcado con un ligando fluorescente; la señal se mide mediante inmunoensayo.

Secuencia de componentes

Fuente de luz policromática → selector de longitud de onda → cubeta → monocromador → detector.

Aplicaciones

Moléculas con dobles y triples enlaces conjugados, de estructura rígida, que proceden de analitos de interés biomédico.