Diagnóstico Serológico en Microbiología: Técnicas, Procedimientos y Pruebas de Sensibilidad Antimicrobiana

Diagnóstico serológico

Diagnóstico serológico: reacción antígeno-anticuerpo in vitro, visualización de reacciones serológicas. Permite buscar el anticuerpo específico mediante el antígeno, o de forma inversa. Se utiliza en el diagnóstico de enfermedades, ya que no puede aislar el germen; es ideal para demostrar la elevación de anticuerpos entre dos muestras de suero separadas entre 10 y 14 días, con pulcritud y exactitud.

Prueba

Se realiza una extracción de 5 a 10 ml de sangre, se deposita en un tubo, se coagula y se obtiene el suero mediante centrifugado para separarlo. En los primeros días aparecen anticuerpos de clase IgM, que suprimen el antígeno microorganismo infectante; posteriormente persisten los anticuerpos IgG, que pueden durar años o toda la vida.

• Infección actual: se confirma con dos muestras, una en la enfermedad precoz y otra en el periodo de convalecencia.
• Si la cantidad de anticuerpos aumenta en la segunda muestra, indica infección actual.
• Si los anticuerpos se mantienen estables, indican infección antigua.

Consiste en enfrentar el suero con el antígeno del microorganismo causante de la infección.

Aglutinación

Si el antígeno está en la superficie, la reacción antígeno-anticuerpo produce aglutinación. Existen dos tipos:

• Directa: el anticuerpo aglutina en flagelos o lipopolisacáridos.
• Pasiva: el antígeno se fija en la superficie de formas inertes.

Aglutinación indirecta en porta

Se mezcla el suero en el portaobjetos con igual volumen de antígeno, se agita y se observa la aglutinación.

Aglutinación indirecta en tubo

Se mezclan diluciones seriadas del suero con una cantidad igual de antígenos y se observa la aglutinación en el tubo. Una dilución elevada produce una reacción visible, lo que permite determinar el título de anticuerpos. La dilución seriada se realiza en proporción 1:2 con diluyente salino.

Reacciones de precipitación (inmunoprecipitación)

Permiten el análisis cuantitativo y cualitativo en medio gelificado. Son específicas, poco sensibles y requieren gran cantidad de anticuerpos. Se utilizan parejas de pocillos en gel de agarosa a pH 8,6, que enfrentan la muestra al antígeno y al antisuero en un campo eléctrico: el antígeno cargado migra hacia el polo positivo, mientras que las inmunoglobulinas neutras migran en sentido contrario por flujo osmótico.

Neutralización (citopática)

Se basa en el bloqueo de la acción citopática del virus en un sistema celular por su anticuerpo específico. Se enfrenta el virus con el suero del paciente: si no hay anticuerpos, al inocularlos se produce acción citopática; si el suero contiene anticuerpos que neutralizan el virus, los inoculados no producen alteración.

Inmunofluorescencia

Procedimiento desarrollado en 1941 que permite observar inmunocomplejos al microscopio con luz ultravioleta, mediante la conjugación de anticuerpos con un colorante fluorescente que no altera sus propiedades inmunológicas.

Método sándwich

Permite detectar anticuerpos antitisulares: (1) se aplica una solución de antígeno sobre el tejido problema; (2) se añade el anticuerpo específico fluorescente.

Método indirecto

Se aplican antiglobulinas fluorescentes tras la conjugación y se observan al microscopio, con controles positivos y negativos para evaluar la sensibilidad del método.

PCR (reacción en cadena de la polimerasa)

Es un método sencillo para amplificar un fragmento de ADN, basado en secuencias cortas de nucleótidos sintéticos (cebadores) y en la acción de una polimerasa que replica el ADN en una reacción automatizada. Contiene: ADN diana de la muestra, cebadores, ADN polimerasa termoestable (no se desnaturaliza con la temperatura) y desoxirribonucleósidos trifosfato.

Se realiza en ciclos térmicos automatizados en un termociclador: (1) se desnaturaliza el ADN separando las dos cadenas; (2) los cebadores se unen a las zonas complementarias; (3) la Taq polimerasa sintetiza el ADN a partir del cebador. El ciclo se repite unas 30 veces.

Problemas habituales:

1. Contaminación de los reactivos.
2. Contaminación cruzada entre muestras.
3. Acumulación de productos de PCR en el instrumental.

Western Blot

Permite la separación de antígenos proteicos cuando la muestra es compleja, y es de gran utilidad para identificar el antígeno específico de un microorganismo. Las proteínas se separan por su peso molecular en un gel de poliacrilamida bajo campo eléctrico, se transfieren a una membrana de nitrocelulosa y se efectúa la reacción serológica: las proteínas separadas se incuban con el suero, los anticuerpos se fijan a los antígenos y se revela con un anti-Ig humana, apareciendo una banda coloreada mediante acción enzimática.

Pruebas de sensibilidad antimicrobiana

Antibiogramas (método Kirby-Bauer)

Se prepara el medio de cultivo con agar y el inóculo: se toman de 4 a 5 colonias y se hacen crecer en caldo tioglicolato. Con una torunda se inocula la superficie del medio y se colocan los discos de papel filtro con antibiótico. Tras la incubación se observa la inhibición del crecimiento, que se manifiesta como un halo alrededor del disco.

Errores frecuentes

• Medio: en mal estado o con volumen incorrecto.
• Antibiótico: concentración errónea o demora en su uso.
• Microorganismo: exceso de inóculo o demora en la siembra.
• Observador: errores en la lectura.

Dilución en agar (CMI)

Permite obtener datos cuantitativos de la sensibilidad del germen frente a antibióticos a distintas concentraciones, para determinar la concentración mínima inhibitoria (CMI). Se prepara el medio de cultivo adecuado, se reparte en varios tubos y cada tubo contiene el antibiótico en una concentración diferente. Cada tubo se vierte en una placa distinta, se solidifica, se inocula con 4 a 5 colonias, se incuba y se observa la inhibición.

Dilución en microcaldo

Permite obtener la CMI mediante una serie de tubos con un volumen exacto de medio de cultivo adecuado. Se homogeneiza, se inocula el germen y se incuba durante 18 horas a 35-38 ºC. Se comprueba la turbidez de cada tubo para determinar dónde se ha producido el crecimiento bacteriano: la concentración menor de antibiótico que impide el crecimiento corresponde al antibiótico más efectivo.