Diagnóstico de la brucelosis bovina: prueba de Rosa de Bengala y ELISA, protocolos e interpretación

Introducción

• No hay ninguna prueba serológica aplicada aisladamente que pueda descubrir la totalidad de los casos de brucelosis.
• La selección y aplicación de los métodos diagnósticos en los programas de control y erradicación de la enfermedad depende de la especie animal, la población bajo vigilancia, la tasa de prevalencia e incidencia en las diferentes regiones y los programas de vacunación.
• En Chile, la prueba de aglutinación Rosa de Bengala y el ensayo de unión primaria ELISA son métodos utilizados en el diagnóstico y confirmación de la brucelosis en bovinos.
• En la medida en que se controle y erradique la infección en los animales, se evita la infección en el ser humano.

Prueba de Rosa de Bengala

• Prueba de aglutinación, económica, rápida y sencilla.
• Utiliza antígeno coloreado con Rosa de Bengala y tamponado a pH bajo, normalmente a 3,65 ± 0,05.
• Las inmunoglobulinas responsables de la reacción son IgG1 principalmente.
• Es una prueba muy sensible.
• Puede originar una reacción positiva debido a la vacunación con la cepa S19 de B. abortus o a reacciones serológicas positivas falsas.
• Las reacciones positivas deben confirmarse con un sistema confirmatorio.

Protocolo

• Las muestras, el procesamiento y el reactivo de Rosa de Bengala deben estar a temperatura ambiente al momento de realizar los análisis.
• Ordene las muestras en gradillas, en corridas de 10 sueros de acuerdo al número correlativo del protocolo de muestras.
• Verifique que estén todas las muestras que vienen registradas en el protocolo correspondiente; anote de inmediato las muestras faltantes o sobrantes, tubos sin suero, quebrados, identificación ilegible y las no aptas para su análisis.
• Centrifugue las muestras (1500 rpm x 5 min), solo cuando las muestras lo requieran.
• Deposite en el centro del primer cuadrado superior izquierdo de la placa 30 µl de la primera muestra. Ocupe los cuadrados de la placa en orden horizontal, de izquierda a derecha, para las muestras siguientes.
• Pruebe simultáneamente un número no mayor de 30 muestras. Coloque 30 µl del antígeno RB al lado de cada muestra de suero, evitando la mezcla.
• Diariamente, coloque un suero control positivo (+) y un suero control negativo (–) para corroborar los análisis del día.
• Con agitador múltiple limpio y seco, mezcle bien el antígeno y el suero, ocupando una superficie circular de 23 a 24 mm.
• Haga girar la lámina en un mezclador de placa durante 4 min, a razón de 10 a 12 rpm, en un ángulo que no signifique desplazamiento de la mezcla. Cuide que todas las preparaciones logren rápidamente una mezcla homogénea.
• Lectura exactamente a los 4 minutos sobre el aglutinoscopio.

Interpretación de resultados

• No reaccionante (NR): muestra en la que no se observa aglutinación y la preparación tiene un color rosa uniforme y translúcido al paso de la luz.
• Reaccionante (R): muestra en la que sí se observa aglutinación en cualquier grado.

Enzimoinmunoensayo (ELISA)

• Se basa en la interacción del anticuerpo con su antígeno y la posterior detección del complejo inmune mediante un reactivo anti-Ig asociado a un sistema de detección enzimático (conjugado).
• La actividad de la enzima adherida se mide por la adición de un agente químico que provoca un cambio de color (cromógeno).
• La intensidad es directamente proporcional a la cantidad de enzima presente y ésta, directamente relacionada a la cantidad de conjugado presente.

Protocolo

• Adsorción de antígeno: cada pocillo de las microplacas de poliestireno (NUNC) de 96 pocillos se incuba con el antígeno contenido en 100 μl de buffer carbonato 0,1 M, pH 9,6, por 18 horas a 4 °C.
• Bloqueo: el contenido no adsorbido se elimina por inversión de la microplaca para luego agregar 200 μl por pocillo de buffer de bloqueo elaborado en buffer fosfato salino (PBS) con leche descremada al 5%, incubando por 2 horas a temperatura ambiente. El bloqueo logra saturar todos los sitios disponibles remanentes en la matriz.
• Lavado: se elimina el contenido por inversión de la placa y se realiza un ciclo de 3 lavados con PBS pH 7,2 más Tween 20, en un volumen aproximado de 300 μl por pocillo.
• Dilución de controles y muestras: se disponen sueros problema y sueros control en duplicado, diluidos a razón de 1:50 en PBS-leche descremada al 0,5% pH 7,2, en una cantidad de 100 μl por pocillo, por un período de incubación de 60 min a 37 °C.
• Lavado: se realiza un nuevo ciclo de lavado.
• Conjugado: como sistema de detección, se adicionan 100 μl del anticuerpo conjugado con peroxidasa, anti-Ig ovina (elaborado en burro), diluido en una solución de PBS pH 7,2 en concentración de 1:5000, para ser incubado 60 min a 37 °C.
• Lavado: se realiza un nuevo ciclo de lavado.
• Cromógeno: se agregan por pocillo 100 μl de una solución reveladora TMB más peróxido de hidrógeno y se incuba a 37 °C por 10 min en oscuridad, permitiendo el desarrollo de color.
• Lectura: la lectura de las densidades ópticas de cada pocillo se efectúa en un espectrofotómetro a 370 nm.

Interpretación de resultados

• Se expresan en densidad óptica (D.O.).
• Utilizando lectura en un solo punto de tiempo, la forma más simple para decidir si una muestra es positiva o negativa es tomar el doble de la densidad óptica del reactivo control negativo. Al utilizar este valor de descarte, las lecturas de densidad óptica superiores a él serán positivas.
• Un segundo método para determinar positividad es utilizar un reactivo control positivo como referencia del 100%.
• Los valores que superen un cierto porcentaje de positividad deben considerarse positivos.