Separación de linfocitos: Ficoll, MACS, inmunotoxicidad, panning y lana de nailon

Resumen

El documento describe las principales técnicas de aislamiento y purificación de linfocitos en inmunología. Explica la separación de células mononucleares mediante gradiente de Ficoll y compara métodos avanzados como la separación inmunomagnética (MACS), la inmunotoxicidad con complemento, el panning y la filtración con lana de nailon. El estudiante aprenderá el fundamento, las ventajas y las limitaciones de cada método.

Puntos clave

El gradiente de Ficoll separa los leucocitos mononucleares (linfocitos y monocitos) de la sangre periférica diluida.
Tras la centrifugación, los granulocitos y eritrocitos quedan en el fondo del tubo y las células mononucleares se recogen en la interfase plasma-medio.
MACS usa micropartículas magnéticas unidas a anticuerpos y puede hacerse por selección positiva o negativa.
La inmunotoxicidad elimina células no deseadas con anticuerpos monoclonales y complemento de conejo, con una incubación de 1 hora a 37ºC.
El panning utiliza placas de plástico tapizadas con anticuerpos que retienen selectivamente a los linfocitos B.
En la filtración con lana de nailon los linfocitos B y monocitos se adhieren y los linfocitos T pasan, aunque el rendimiento es bajo.

Ponte a prueba

TÉCNICAS FUNDAMENTALES DE SEPARACIÓN DE LINFOCITOS

1. Separación de Linfocitos por Centrifugación en Gradiente de Ficoll

Esta es la prueba más habitual para obtener preparaciones de linfocitos de sangre periférica para realizar pruebas in vitro. Este método separa los leucocitos mononucleares (linfocitos y monocitos, aunque los linfocitos son mucho más abundantes).

Componentes del Medio de Separación

El medio de separación es crucial para el éxito de la técnica:

Ficoll 400: El Ficoll tiene una densidad mayor que la de los linfocitos, pero menor que la de los eritrocitos y granulocitos. Además, provoca la aglutinación de los eritrocitos.
Diatrizoato de Sodio: Junto con el Ficoll, forma soluciones de baja viscosidad y alta densidad. Provee la densidad óptima para la separación de las células y la osmolaridad necesaria para mantener su viabilidad.

Nota: Existen preparaciones comerciales listas para su uso.

Fundamento de la Separación por Centrifugación

La técnica se basa en la centrifugación de la sangre total desfibrinada diluida, la cual se deposita sobre el medio de separación. Durante este proceso ocurre lo siguiente:

A. Granulocitos: Al ser más densos que el medio, quedan depositados en el fondo del tubo.
B. Eritrocitos: Se aglutinan en contacto con el Ficoll y también se depositan en el fondo del tubo.
C. Células Mononucleares: Permanecen en la interfase entre el plasma y el medio de separación, donde pueden ser recolectadas.

MÉTODOS AVANZADOS DE FRACCIONAMIENTO CELULAR

2. Otros Métodos de Separación de Poblaciones Linfocitarias

Separación Celular Inmunomagnética (MACS)

La técnica más conocida es la denominada MACS (Magnetic Activated Cell Sorting), que utiliza partículas magnéticas que permiten el marcado magnético de las células mediante anticuerpos (Ac). Las micropartículas son biodegradables, por lo que no requieren su eliminación. Esta técnica permite:

Selección Positiva: La población deseada es marcada magnéticamente y aislada en la fracción celular retenida.
Selección Negativa: Se eliminan las células no deseadas mediante marcado magnético y se eluye la fracción que contiene la población deseada no marcada.

Técnicas de Inmunotoxicidad

Se utiliza la capacidad lítica del complemento para eliminar las poblaciones celulares no deseadas. Las células que se desean eliminar se marcan con anticuerpos monoclonales específicos de sus marcadores de membrana, para posteriormente adicionar complemento de conejo. Después se incuba durante 1 hora a 37ºC y las células lisadas por el complemento se eliminan mediante dos lavados. Es una técnica rápida y barata. Se puede usar para purificación celular y para enriquecimiento de poblaciones celulares.

Panning de Linfocitos

Es un método de separación sencillo desarrollado para el fraccionamiento de Linfocitos T y B. Se utilizan placas de plástico tapizadas con anticuerpos específicos que se unen selectivamente a los Linfocitos B (LB). Los anticuerpos se unen de forma no covalente a la placa de plástico, a la que se añade la mezcla celular. Aquellas células que expresen en su superficie el receptor complementario se unirán a los anticuerpos fijados a la placa y las demás podrán ser eliminadas mediante un posterior lavado.

Filtración con Columnas de Lana de Nailon

Los Linfocitos B (LB) y monocitos/macrófagos se adhieren a la lana de nailon, mientras que los Linfocitos T (LT) no lo hacen. Se utiliza una columna o una jeringa llena de nailon, a través de la cual se hace pasar la muestra debidamente diluida, gota a gota. Los LB se quedan adheridos, mientras que los LT pasan y se pueden recoger. Esta es una técnica de bajo rendimiento.

Preguntas frecuentes

¿Qué células se obtienen en la separación con Ficoll?

Se obtienen los leucocitos mononucleares, principalmente linfocitos y, en menor proporción, monocitos. Quedan en la interfase entre el plasma y el medio de separación.

¿Qué diferencia hay entre selección positiva y negativa en MACS?

En la selección positiva la población deseada queda marcada y retenida. En la negativa se marcan y eliminan las células no deseadas, y la población buscada se recoge sin marcar.

¿Por qué la lana de nailon separa linfocitos T de B?

Los linfocitos B y los monocitos/macrófagos se adhieren a la lana de nailon, mientras que los linfocitos T no se adhieren y pasan a través de la columna.