Vectores de clonación: plásmidos, fago λ y cósmidos en biología molecular

Vectores de Clonación en Biología Molecular

Plásmidos

Los fragmentos de restricción de ADN no pueden entrar sin más en las células huésped para ser clonados. Lo consiguen insertándose en moléculas de ADN llamadas vectores. Es decir, los vectores son esencialmente moléculas de ADN transportadoras. Los vectores de clonación más empleados actualmente se describen a continuación:

Bacteriófagos

Los vectores plasmídicos transportan, generalmente, hasta 10 kb de ADN insertado. En ciertos experimentos son necesarios trozos más largos, en estos casos los vectores son ciertos bacteriófagos. Un bacteriófago es un virus que infecta exclusivamente a bacterias. Uno de los más utilizados es el fago λ. El método seguido para clonar ADN utilizando como vector el fago λ consiste en extraer el ADN de una preparación de fago y en la eliminación del grupo central de genes por tratamiento con una enzima de restricción. El ADN a clonar se corta con la misma enzima y se liga entre los brazos del cromosoma del fago. Luego, se empaqueta el cromosoma recombinante dentro de las proteínas del fago para formar un virus recombinante. Este virus puede infectar células bacterianas y replicar su cromosoma, incluido el inserto de ADN. Las placas de lisis o “calvas”, correspondientes a células infectadas, aparecen sobre un césped bacteriano.

Cósmidos

Son vectores híbridos, que se construyen a partir de fragmentos de distintas procedencias que se unen in vitro tras cortarse con la misma enzima de restricción. La ligasa sella la zona híbrida. Los cósmidos son construidos mediante la unión de partes del cromosoma del fago lambda y de plásmidos. Contienen la secuencia “cos” del fago λ, necesaria para el empaquetamiento del ADN del fago dentro de la cubierta proteica, y contienen también secuencias plasmídicas necesarias para la replicación. Tienen, además, genes de resistencia a antibióticos de origen plasmídico que nos ayudan a identificar las células huésped que contienen los cósmidos recombinantes. Después de insertar fragmentos de ADN, los cósmidos recombinantes se empaquetan en la cápside proteica para formar partículas de fago infectivas. Una vez dentro de la célula huésped bacteriana, el cósmido se replica como un plásmido. Los cósmidos pueden transportar casi 50 kb de ADN insertado, mucho más que lo que puede llevar el vector lambda.

Detección de Proteínas Específicas: Western Blot o Inmunoblot

El Western blot, o inmunoblot, es una técnica analítica usada para detectar proteínas específicas en una muestra determinada (una mezcla compleja de proteínas, como un extracto tisular). Mediante una electroforesis en gel se separan las proteínas atendiendo al criterio que se desee: peso molecular, estructura, hidrofobicidad, etc. Hay casi tantas posibilidades como tipos de electroforesis existen. Luego son transferidas a una membrana adsorbente (nitrocelulosa o de PVDF, polivinildifluoruro) y se une a la molécula transferida un anticuerpo (Ab) específico marcado con una enzima. Por último, se añade un sustrato apropiado para dicha enzima de manera que se forme un producto detectable (coloreado o fluorescente). Existen dos métodos de detección:

• Directo: el anticuerpo primario marcado se une al antígeno (Ag) de la membrana y reacciona con el sustrato originando una señal detectable.
• Indirecto: el anticuerpo primario sin marcar reacciona con el antígeno. Luego un anticuerpo secundario marcado se une al primero y reacciona con el sustrato, originando una señal detectable.