Turbidimetria y nefelometría

TEMA 2. ESPECTROSCOPIA DE FLUORESCENCIA(FLUORIMETRÍA):

1. FUNDAMENTO:

La fluorescencia:

proceso de emisión atómica y/o molecular se produce cuando ciertas moléculas absorben luz de una determinada longitud de onda (Y1), y emiten luz de una longitud de onda superior a la absorbida (Y2), es decir, de menor energía. La intensidad y el color de la luz emitida son carácterísticos de la sustancia fluorescente y no tiene, necesariamente, el mismo color que la luz absorbida.-.-.-.-.El proceso de emisión se produce cuando los átomos o moléculas, previamente excitados, vuelven a su estado fundamental cediendo su exceso de energía en forma de radiación electromagnética (fluorescencia) de distinta longitud de onda a la energía de excitación y que podemos cuantificar.


La luz emitida en la fluorescencia tiene menor energía que el haz de luz incidente, por lo tanto, la luz emitida es de longitud de onda mayor que la correspondiente a la radiación absorbida o de excitación.


La fluorimetría es una técnica de laboratorio que permite determinar el tipo y la intensidad de unaradiación fluorescente emitida por una sustancia que previamente ha sido sometida a la acción de una radiación. El cálculo de la luz fluorescente emitida permite realizar el análisis cualitativo y cuantitativo del compuesto que la emite. Es una técnica sencilla (como otras técnicas fotométricas) y con una alta sensibilidad y especificidad.


La fosforescencia se produce, tras la irradiación de la materia i se mantiene durante un tiempo que oscila desde unos pocos segundos hasta minutos o incluso horas.= q fluorescencia,tiene energ. Electromag.Pero es+lento,absorbe energ y la va acumulando para emitirla poco a poco.


La quimioluminiscenciaes un fenómeno luminiscente que se produce en el transcurso de una reacción química.

2. FACTORES QUE INFLUYEN EN LA FLUORESCENCIA Y FOSFORECENCIA:

Rendimiento cuántico de la fluorescencia es la relación entre el número de moléculas que emiten fluorescencia y el número total de moléculas excitadas. También se puede definir como la relación entre los fotones emitidos (Ie) y los absorbidos (Io).O/=nºmol emitidos/nºmol absorbidos=result entre 0y1.

Tipo de transición

de relajación entre niveles(orbitales).

Estructura molecular

Los compuestos aromáticos, son los que presentan mejor fluorescencia.La rigidez estructural favorece la fluorescencia.

Condiciones de medida:

__La temperatura de medida y la presencia de compuestos pesados en el disolvente se relacionan de forma inversa con la fluorescencia.__pH:

la fluorescencia es diferente dependiendo de la ionización que presenten sus radicales ácidos o básicos.__La presencia de oxígeno disuelto, reduce la intensidad de la fluorescencia.__La potencia de la fluorescencia suele ser lineal a bajas concentraciones de la especie fluorescente,perdíéndose la linealidad al aumentar la concentración.

3. INSTRUMENTACIÓN:

Para medir la fluorescencia emitida por una sustancia sobre la cuál previamente ha incidido una luz de determinada longitud de onda, se pueden emplear flúorímetros -
Utiliza filtros como sistema de selección de longitud de onda- oespectrofluorímetros -
emplea prismas o redes de difracción- para la selección de la longitud de onda tanto de de la luz incidente como de la luz emitida. Generalmente tienen óptica de doble haz para compensar posibles variaciones de potencia de la lámpara.

1. Fuente de luz de excitación:

se emplean lámparas de arco de xenón o lámparas de Mercurio, más prácticas porque emiten líneas de alta intensidad en el rango de las longitudes de onda de excitación apropiadas. Se utiliza también el láser de nitrógeno.

2. Rendijas de excitación (a) y emisión (b):

son similares a las de los espectrofotómetros.

3. Monocromador de excitación (a), emisión (b):

que tienen como finalidad seleccionar la longitud de onda de excitación adecuada y eliminar las longitudes de onda no deseadas emitidas (procedentes de las reflexiones y dispersiones) antes de llegar al detector.Pueden ser filtros de vidrio o filtros de interferencia(flúorímetros),prismas o redes de difracción -espectrofluorímetros-.

4. Cubeta para muestras:

pueden ser de sílice o de cuarzo. No se pueden utilizar las de plástico pues pueden originar una fluorescencia adicional y el método pierde sensibilidad.

5. Sistema de atenuación:

el haz de referencia atraviesa el sistema de atenuación que reduce la potencia del haz hasta valores similares a los de la emisión fluorescente.

6. Detector de la muestra (6) y detector de referencia (7):

son,como en los espectrofotómetros, tubos fotomultiplicadores que permiten multiplicar y cuantificar la señal fluorescente. El monocromador de emisión y el fotomultiplicador se sitúan en un ángulo de 90º


respecto a la energía incidente para evitar que incida luz procedente de la lámpara.

Explicación:

La radiación atraviesa el monocromador de excitación separándose en dos al incidir sobre un espejo.Parte de la radiación atraviesa la cubeta con la muestra llegando al monocromador de emisión y al detector.El haz de referencia atraviesa el sistema de atenuación y el monocromador de emisión de referencia hasta detector de referencia.El procesador mide la relación existente entre la intensidad de la radiación emitida por la muestra y la de referencia obteniendo un dato numérico.

4. ASPECTOS PRÁCTICOS

Las determinaciones fluorimétricas:

pueden ser:

Directas:

se mide la fluorescencia de un compuesto (reactivo + analito).

Indirectas:

miden el aumento o disminución de la fluorescencia del analito cuando reacciona con los reactivos.

Los métodos analíticos fosforimétricos:

se emplean en la determinación de ácidos nucléicos, aminoácidos,pirinas, enzimas, etc.No se emplea tanto como la fluorimetría porque a pesar de su elevada selectividad, presenta mayor imprecisión y más inconvenientes en la medida.-.-.-.Ambas técnicas, la fluorimetría i i la fosforimetria, se emplean como complemento a las técnicas de cromatografía líquida de elevada resolución (HPLC high performance liquid chromatography) al detectar los componentes luminiscentes que son eluidos a través de una columna cromatográfica.

Sensibilidad y especificidad:

Es una técnica entre 100 y 1000 veces más sensible que las colorimétricas ya que en las medidas de absorción la sensibilidad de la medida depende de la proporción de luz absorbida que a su vez dependede la cantidad de cromógeno y de la longitud de paso de luz, y en las medidas de fluorescencia la sensibilidad depende además de estos factores de la intensidad de la fuente de luz

.

La medida de fluorescencia:

se expresa en unidades de intensidad relativa, pues la intensidad medida no es una cantidad absoluta.


Las variaciones en las intensidad de radiación hacen necesario el calibrado diario del flúorímetro o del espectrofluorímetro.


Para hacer el blanco de reactivo,solo se puede establecer el cero o fluorescencia nula, no existe equivalente para establecer el 100% de absorción, por lo que la señal electrónica variará para la misma concentración de sustancia de un instrumento a otro y no se podrán comparar.Esto es importante a la hora de realizar controles de calidad, pues no se pueden realizar controles externos.Cubetas:
A parte de lo que ya hemos comentado anteriormente que tienen que ser de sílice o de cuarzo, éstas no deben presentar ralladuras, porque aumentan la dispersión de la luz; no deben tener marcas de dedos porque se puede producir fluorescencia contaminante o absorción de luz; y se no deben de limpiar con detergentes fluorescentes -se pueden limpiar con ácido nítrico en caliente-.

Condiciones que influyen en la determinación

:-

solvente-pH-temperatura-absorbancia de la luz por la solución-presencia de interferentes que pueden provocar una fluorescencia no deseada

compuestos que atrapan la luz "atenuación de la fluorescencia o quenching" debido a la transferencia de la energía de una molécula a otra.

TEMA 5: NEFELOMETRÍA Y TURBIDIMETRÍA:

1.FUNDAMENTOS:

Cuando un haz de luz atraviesa una suspensión, parte de la luz es absorbida por las partículas, parte es reflejada, parte es dispersada y parte es transmitida.
Io = Ia + Ir + Id + It.-.-.-.
La nefelometría y la turbidimetría son técnicas que están relacionadas con la espectroscopia de absorción molecular en el espectro de la luz visible. En ellas se mide la radiación dispersada -

Nefelometría

O la radiación transmitida -

Turbidimetría-

por la muestra que contiene partículas no transparentes en suspensión en el seno de un líquido.
La turbidimetría mide la radiación bloqueada por las partículas de la muestra, relacionando la intensidad de la luz incidente sobre la muestra y la intensidad de la luz transmitida.
La nefelometría mide la radiación dispersada por las partículas de la muestra, por tanto, el detector se sitúa en ángulos distintos al de la luz incidente.

La cantidad de luz dispersada depende de varios factores:

__concentración de partículas (analito).__volumen, tamaño, peso y número de partículas.__longitud de onda de la radiación incidente.__distancia del detector a la cubeta.
La turbidimetría es la técnica que mide la disminución de la intensidad de un haz incidente cuando pasa a través de una suspensión de partículas y se mide a 0º del haz incidente (en su misma dirección). La disminución de intensidad se puede medir como %T o como absorbancia, por lo que podemos utilizar cualquier espectrofotómetro. La sensibilidad de la técnica depende del espectrofotómetro.-.-.En la turbidimetría se cumple la ley de Lambert-Beer pero, en la práctica, hay que realizar una recta de calibración partiendo de las transmitancias de varias disoluciones de concentración conocida y después, por extrapolación, calcular la concentración de la solución problema.


La nefelometría, es la medida de la luz dispersada por las partículas de la muestra en ángulos distintos al de la radiación incidente, generalmente entre 15 y 90º. La medida se realiza en aparatos especialmente diseñados al efecto, los nefelómetros.

2.INSTRUMENTACIÓN:

1. Fuente de luz:

Pueden utilizarse lámparas de cuarzo, halógenas,xenón, de arco de Mercurio, filamento de tungsteno y láser helioneón.La ventaja del láser es que emite una radiación de gran intensidad y con un pequeño ancho banda por lo que el aparato no necesita la presencia de colimador debido a que produce haces de luz paralelos.

2. Colimador:

su función es corregir la trayectoria de los haces de luz incidente para que incidan en la muestra de manera paralela evitando la divergencia.

3. Selector de longitud de onda:

se pueden utilizar filtros o monocromadores; estos tampoco son necesarios si la fuente de luz es láser.

4. Cubeta:

se utilizan las mismas que las de espectrofotometría.

5. Sistema de detección:

consta de tubos fotomultiplicadores que pueden ser fijos (más utilizados en clínica) o móviles. Estos últimos adoptan una determinada posición en función del ángulo de detección seleccionado de 0 a 90º. La sensibilidad máxima se alcanza situando el detector posición 0º.

6. Lector

El detector capta una fracción de la luz dispersada y la convierte en una corriente eléctrica que medimos en unidades arbitrarias de intensidad luminosa. Si el aparato lleva un microprocesador que almacena los datos que procesa, puede emitir los resultados directamente en concentraciones.

3. ASPECTOS PRÁCTICOS:

Sensibilidad

:

En los nefelómetrosla sensibilidad depende de la lectura del blanco -absorción/dispersión de la luz incidente debido a la muestra o a los reactivos utilizados pero no al analito-.

A menor lectura del blanco de reacción mayor sensibilidad

En los turbidímetros, la sensibilidad depende de las carácterísticas fotométricas del aparato, cuanto mayor sea la capacidad de detectar pequeñas variaciones en la absorción, más sensibilidad.Interferencias

Las partículas que se encuentran como componentes del reactivo al igual que las del suero pueden dar origen a una dispersión de la luz que interfiere en los resultados de la técnica como por ejemplo la presencia de lipoproteínas y quilomicrones en sueros lipémicos.-.-.La forma de evitar este problema es mediante la utilización de técnicas cinéticas.

Igualmente hay que prestar atención a una limpieza cuidadosa de las cubetas y la adecuada conservación y manejo de los reactivos que, en caso contrario, favorecerá la dispersión de la luz y con ello obtendremos resultados erróneos.

Longitud de onda

El suero contiene, además del analito, otros componentes que absorben luz a determinadas longitudes de onda; por ejemplo, las proteínas tienen un pico de absorción por debajo de 300 nm y los cromógenos del suero entre 400-425 nm. Debido a la presencia de estas sustancias, debemos trabajar con longitudes de onda entre 320-380nm y 500-600nm.-.-.En las determinaciones nefelométricas, la dilución del suero reduce la absorción del blanco. Por ejemplo, en las determinaciones basadas en la cuantificación de complejos antígeno-anticuerpo, la utilización de anticuerpos con gran afinidad con el antígeno permite solucionar este problema.

Tipos de análisis:

Se utilizan 2 tipos básicos de medición de la dispersión luminosa en las reacciones antígeno-anticuerpo y se aplican tanto en turbidimetría como en nefelometría. Estas determinaciones son:

Análisis a punto final

requiere la utilización del blanco, y debe transcurrir un tiempo prudencial para la determinación final.

Análisis de velocidad o cinético

estudia el cambio de velocidad de la reacción y no requiere blanco.-.-.En el proceso de formación de complejos antígeno-anticuerpo,encontramos una primera etapa donde la formación del complejo es lenta y no hay casi variación en la dispersión de la luz; en una segunda etapa la dispersión de la luz aumenta rápidamente y finalmente la dispersión se ralentiza permaneciendo casi constante

.Uso de coloides protectores:

En estas técnicas se trabaja con suspensiones con el objetivo de que sean homogéneas y estables. Es aconsejable el uso de coloides como el polietilenglicol, para aumentar la estabilidad en el tiempo de la suspensión y así poder reproducir con exactitud los resultados.