Transfusión sanguínea y hemocompatibilidad: conceptos, sistemas sanguíneos y pruebas

Transfusión: definición y objetivos

La transfusión es un procedimiento mediante el cual se pasa sangre o alguno de sus componentes de un donante a un receptor. Los objetivos de las transfusiones pueden ser diversos: reponer el volumen sanguíneo, aumentar la hemoglobina y la capacidad de transporte de oxígeno o corregir los niveles de proteínas u otros componentes de la sangre. Un factor determinante para realizar una transfusión es la compatibilidad entre donante y receptor, es decir, la garantía de que no se producirá una reacción inmunológica entre antígenos (Ag) y anticuerpos (Ac) de donante y receptor.

Antígenos y grupos sanguíneos

Las células sanguíneas poseen en su membrana proteínas y polisacáridos que pueden actuar como antígenos y provocar la formación de anticuerpos en las personas que carecen de ellos. Los antígenos presentes en las células sanguíneas determinan el grupo sanguíneo, que condicionará la compatibilidad entre la sangre de distintas personas.

Un sistema de grupo sanguíneo consiste en uno o más antígenos presentes en células sanguíneas y que están codificados por un locus o por dos o más genes homólogos estrechamente ligados.

Reacciones antígeno-anticuerpo (Ag-Ac)

REACCIONES Ag-Ac: Cuando un anticuerpo entra en contacto con el antígeno contra el que está dirigido, ambos se unen formando el complejo Ag-Ac. Estas reacciones pueden dar lugar a dos fenómenos que se manifiestan tanto in vivo como in vitro:

• Hemólisis: destrucción de los hematíes por unión Ag-Ac en presencia de complemento.
• Aglutinación: agrupamiento de una suspensión de partículas al reaccionar con sus anticuerpos específicos.

Potenciadores de la reacción Ag-Ac

Algunos reactivos y condiciones mejoran la sensibilidad o la velocidad de las reacciones Ag-Ac:

• Soluciones de baja fuerza iónica (LISS): aumentan la fijación del Ac y aceleran la asociación entre Ac y Ag.
• PEG (polietilenglicol): extrae moléculas de agua y permite la unión Ac-Ag.
• Albúmina: disminuye la repulsión electrostática de los hematíes.
• Enzimas proteolíticas: eliminan ácido siálico de la membrana y pueden potenciar ciertas reacciones.

Aglutinación inespecífica

También existe la aglutinación inespecífica, llamada fenómeno de panaglutinación. Los glóbulos rojos no sensibilizados por anticuerpos pueden aglutinarse por sustancias presentes en el medio de la suspensión, por ejemplo:

• Detergentes.
• Iones metálicos: Cr, Al, Fe.
• Macromoléculas: albúmina, polibreno, dextran, etc.

Tipos de anticuerpos

Los anticuerpos más importantes en las reacciones debidas a transfusiones son de tipo IgG e IgM, y muy rara vez IgA.

Las IgG pueden fijar complemento y, debido a su tamaño, pueden atravesar la barrera hematoplacentaria y provocar la enfermedad hemolítica del recién nacido (EHRN). Las IgM son aglutininas potentes, a menudo activan complemento eficazmente; tienen forma de pentámero y un alto peso molecular, por lo que no atraviesan la barrera hematoplacentaria. Las IgA están presentes en secreciones; en plasma son principalmente monómeros.

Antígenos del sistema ABO

En este sistema los antígenos son A y B, y establecen los cuatro grupos sanguíneos según existan en la membrana uno de ellos, ambos o ninguno. Su presencia viene determinada genéticamente y se hereda según las leyes de Mendel.

En el cromosoma 9 existe un locus ocupado por uno de estos genes: A, B, 0. Cada individuo posee dos alelos (uno paterno y otro materno), por lo que los genotipos posibles son: AA, AB, BB, AO, BO, 00, obteniendo los fenotipos: A, AB, B, O.

Estos genes productores de antígenos están relacionados con el sistema Hh, que tiene dos alelos: el gen H (frecuente) y el gen h (amorfo o nulo). Los genotipos HH y Hh sintetizan una enzima que añade L-fucosa a una sustancia precursora formando la sustancia H. Sin la sustancia H no pueden formarse A ni B (fenotipo Bombay, ver más adelante).

• El gen A codifica una transferasa que añade N-acetil-galactosamina a la sustancia H, transformándola en sustancia A.
• El gen B codifica una transferasa que añade D-galactosa a la sustancia H, transformándola en sustancia B.
• El gen 0 es amorfo y no altera la estructura de la sustancia H.

Siempre persistirá algo de sustancia H en los hematíes, ya que no toda la sustancia H se transforma en A o B.

Grupos sanguíneos ABO

• Grupo A: los hematíes presentan antígeno A.
• Grupo B: los hematíes presentan antígeno B.
• Grupo AB: los hematíes presentan antígenos A y B.
• Grupo O: los hematíes no presentan antígeno A ni B; solo tienen sustancia H.

Grupo Bombay (Oh)

Los individuos con genotipo hh son incapaces de producir sustancia H, por lo que los genes del sistema ABO no pueden expresarse y fenotípicamente parecen del grupo O. Estos individuos presentan anticuerpos Anti-A, Anti-B y un anticuerpo natural Anti-H, muy activo a 37 °C, capaz de producir hemólisis frente a hematíes de cualquier individuo que no sea fenotipo Bombay.

Fenotípicamente, con la prueba celular estas personas se clasifican como grupo O, pero en la prueba sérica su suero presenta una fuerte aglutinación con hematíes de todos los grupos, incluido el O.

Anticuerpos naturales en el sistema ABO

Una característica del sistema ABO es que el suero presenta anticuerpos fuertemente reactivos contra los antígenos que no están presentes en los eritrocitos propios. Por ejemplo:

• Si una persona es de grupo A, en su suero se detectan anticuerpos anti-B.
• Si es de grupo B, se detectan anticuerpos anti-A.
• Si es de grupo O, se detectan anticuerpos anti-A y anti-B.
• Si es de grupo AB, no presenta anticuerpos anti-A ni anti-B.

Estos anticuerpos son naturales, es decir, están presentes sin haber tenido contacto previo con hematíes del grupo contrario, porque las cadenas de azúcares que caracterizan los antígenos ABO son frecuentes en bacterias y alimentos, lo que induce inmunización natural.

Subgrupos A y B

Los subgrupos mayoritarios del grupo A son A1 (≈80%) y A2 (≈20%). Entre ambos existen diferencias cuantitativas y cualitativas:

• El subgrupo A2 presenta menor cantidad de antígeno.
• El antígeno A2 está menos ramificado que el A1. Esta diferencia hace que los hematíes A1 aglutinen con la lectina de Dolichos biflorus, mientras que los A2 no lo hacen. Algunos A2 pueden producir anticuerpos anti-A1.

Nota: en el texto original se hace referencia a una observación de hemólisis en tubos concretos; esas pruebas deben interpretarse en el contexto de laboratorio.

Sistema Secretor

Existe un gen secretor (Se) que determina la presencia de las mismas sustancias antigénicas en las secreciones corporales (saliva, semen) que en los hematíes. Los genotipos SeSe y Sese presentan sustancias H, A y/o B en las secreciones, mientras que los homocigotos sese no las tendrán. Esto es útil cuando la detección del grupo sérico y hemático no es concluyente.

Sistema Rh

El sistema Rh debe su nombre al macaco Rhesus. Se han descrito más de 50 antígenos en este sistema, pero los principales son cinco: D, C, c, E y e. Estos antígenos son glicoproteínas integrales de la membrana de los hematíes.

Los términos Rh positivo y Rh negativo se refieren a la presencia o ausencia del antígeno D, que es altamente inmunogénico:

• Personas con antígeno D: Rh positivas (≈85%) — solo pueden donar a receptores Rh positivos (en transfusión directa sin otras consideraciones).
• Personas sin antígeno D: Rh negativas — pueden donar a individuos Rh positivo y Rh negativo (en la práctica clínica deben considerarse otros antígenos).

El antígeno D se detecta mediante una prueba de aglutinación directa con suero anti-D.

Genética del sistema Rh

En el cromosoma 1 se encuentran dos genes estrechamente ligados y con alto grado de homología:

• Gen RHD: codifica el antígeno D. Su expresión genera el fenotipo Rh positivo; la ausencia de expresión (deleción u otras alteraciones) determina el fenotipo Rh negativo.
• Gen RHCE: codifica los antígenos C, c, E y e. Existen cuatro formas alélicas de este gen: CE, Ce, cE y ce, cada una determinando la expresión de una pareja de antígenos.

Además existe el gen RHAG, que codifica una glicoproteína asociada a Rh necesaria para la expresión del sistema; mutaciones en RHAG pueden originar fenotipos Rh nulos.

Características clínicas de los anticuerpos Rh

Los anticuerpos contra antígenos Rh suelen ser inmunes, activos a 37 °C, no fijan complemento, son clínicamente significativos y generan destrucción eritrocitaria extravascular (sistema mononuclear fagocítico). Pueden provocar enfermedad hemolítica del recién nacido. Los más frecuentes son anti-D, anti-E y anti-c.

Antígeno Du y variantes parciales de D

Antígeno Du: variante débil del antígeno D. Aglutina débilmente o no aglutina con los Ac anti-D habituales, y puede llevar a clasificar erróneamente como Rh negativo a un portador de Du. La transfusión de esa sangre a una persona Rh negativa puede inducir Ac anti-D; por ello, si la sangre aparenta ser Rh negativa, se investiga la presencia de Du con la prueba de Coombs.

Antígenos D parciales: en ocasiones un individuo D positivo carece de alguna fracción del mosaico D y puede inmunizarse contra la parte ausente. El anticuerpo producido reaccionará con eritrocitos Rh positivos completos (aunque no con los propios), lo que puede dar la falsa impresión de un autoanticuerpo anti-D en un sujeto Rh positivo.

En el contexto transfusional, la presencia de variantes parciales o débiles del antígeno D debe interpretarse de la siguiente forma:

• Como Rh positivo si se trata de un donante.
• Como Rh negativo si se trata de un paciente o receptor de transfusión.

Otro fenotipo raro es el Rh null. Los eritrocitos de estos individuos carecen de todos los antígenos del sistema Rh. La causa principal es una mutación en RHAG que altera la glicoproteína asociada a Rh, provocando anemia hemolítica crónica con aumento de la fragilidad osmótica, esferocitosis y estomatocitosis.

Compatibilidad y elección de sangre

Respecto a la compatibilidad ABO, es preferible recurrir a sangre del mismo grupo. Para receptores con grupo AB (receptor universal en términos de eritrocitos), el orden de preferencia es: AB > A > B > O.

Otros sistemas de grupos sanguíneos

Sistema Ii

Los antígenos de este sistema son i (neonatos) y I o l (adultos). Algunas personas tienen anticuerpos fríos anti-I o anti-i, que son inactivos a temperatura corporal pero pueden producir hemólisis si reaccionan a 30 °C. Si se necesita transfusión en estos casos, las unidades deben calentarse a temperatura fisiológica mediante dispositivos adecuados.

Sistema Lewis

Antígenos: Lea, Leb y combinaciones. Los anticuerpos anti-Lewis suelen ser naturales y actúan a 22 °C, con escasa relevancia transfusional. No obstante, algunos anti-Lewis activos a 37 °C pueden ser hemolizantes. Si se detectan anticuerpos anti-Lea, anti-Leb o anti-Lea+b en una persona que requiere transfusión, deben seleccionarse hematíes compatibles a 37 °C y realizar test de antiglobulina.

Sistema P

El antígeno principal es P1. Las personas con fenotipo P1 expresan P1 en sus eritrocitos; las que carecen lo son P2. El anti-P1 suele ser IgM natural y no activo a 37 °C, aunque en ocasiones puede ser IgG y activo a 37 °C, causando reacciones hemolíticas.

Sistema MNS

Antígenos: M, N, S, s. Los anticuerpos contra este sistema pueden ser naturales o inmunes y pueden provocar hemólisis; en caso necesario hay que transfundir sangre carente de los antígenos correspondientes.

Sistema Kell

El antígeno K (Kell) es un inmunógeno potente pero poco frecuente. El alelo k (Cellano) es muy frecuente. Los anticuerpos del sistema Kell son IgG inmunes y se detectan con la prueba de antiglobulina indirecta. Este sistema contiene muchos antígenos clínicamente significativos que pueden producir reacciones hemolíticas postransfusionales y EHRN.

Sistema Kidd

Antígenos: Jka y Jkb. Los anticuerpos Kidd tienen carácter evanescente: tras la inmunización su título disminuye hasta niveles indetectables, por lo que ocasionan con frecuencia reacciones hemolíticas retardadas.

Sistema Duffy

Antígenos: Fya y Fyb. Moderadamente inmunogénicos y se detectan con la prueba de antiglobulina indirecta. El anti-Fya es más común que el anti-Fyb; estos anticuerpos se observan con más frecuencia en individuos de raza negra y en pacientes politransfundidos.

Sistema Lutheran

Los principales antígenos son Lua y Lub. Los anticuerpos causan patología leve en general.

Patologías relacionadas con hemocompatibilidad

Reacciones transfusionales

En las últimas décadas ha mejorado la seguridad en las transfusiones; sin embargo, la transfusión con sangre incompatible sigue siendo una causa importante de morbilidad y mortalidad. Una transfusión ABO incompatible tiene grandes riesgos; incluso pequeñas cantidades pueden ser fatales. La destrucción de eritrocitos ocurre intravascularmente y es inmediata, produciendo coagulación intravascular diseminada (CID), fallo renal y muerte.

Las causas más comunes no se asocian a errores técnicos del laboratorio, sino a errores administrativos, como identificación incorrecta de pacientes o de unidades a transfundir.

Reacciones transfusionales inmunológicas

Se deben a la presencia en la sangre de antígenos para los que el receptor tiene anticuerpos o puede sintetizarlos. A continuación se describen situaciones clínicas relevantes:

Reacción transfusional hemolítica aguda

Ocurre durante las cuatro horas posteriores a la transfusión y se debe a anticuerpos preexistentes en el receptor que reaccionan con los hematíes transfundidos. La más habitual es debida al sistema ABO. Los anticuerpos activan complemento, ocasionando hemólisis intravascular, activación del sistema de coagulación y CID, hipotensión, hemoglobinemia, hemoglobinuria, choque y fallo renal. Es fundamental detener la transfusión ante cualquier reacción sospechosa.

Reacción transfusional hemolítica retardada

Se debe a la producción de anticuerpos entre 5 y 14 días tras la transfusión. Son anticuerpos no detectables antes de la transfusión; clínicamente hay descenso inexplicable de hemoglobina y aumento de bilirrubina indirecta, con escasa sintomatología. Es preciso identificar el antígeno causante para evitarlo en futuras transfusiones.

Reacción transfusional febril no hemolítica

Debida a anticuerpos del receptor dirigidos contra leucocitos o plaquetas del donante. Su incidencia disminuye con la leucorreducción. Se caracteriza por tiritona, fiebre y escalofríos; a veces hay hipertensión, nunca hipotensión.

Reacciones transfusionales infecciosas

Los componentes sanguíneos pueden transmitir agentes infecciosos procedentes del donante o por contaminación:

• Reacción séptica por contaminación bacteriana: requiere análisis de las bolsas, identificación del microorganismo y antibiograma; iniciar antibioterapia de amplio espectro.
• Infecciones virales y otras: hepatitis (A, B, C, G), Epstein-Barr, VIH, HTLV, citomegalovirus, sífilis (Treponema pallidum), enfermedad de Chagas (Trypanosoma cruzi), etc. La normativa exige pruebas obligatorias a la sangre y criterios de exclusión de donantes para minimizar riesgos.

Enfermedad hemolítica del recién nacido (EHRN)

La EHRN es la hemólisis fetal o neonatal de los hematíes debida al paso de anticuerpos maternos a través de la placenta. La hemólisis produce anemia y aumento de bilirrubina; si es grave puede causar muerte intrauterina. La bilirrubina fetal se elimina por la placenta, pero si persiste tras el parto puede depositarse en el cerebro y producir kernicterus o encefalopatía neonatal bilirrubínica.

Cuando los hematíes de la madre carecen de un antígeno que sí contiene el feto, la madre puede sensibilizarse y producir anticuerpos que atraviesen la placenta y provoquen hemólisis fetal. El paso de anticuerpos comienza alrededor de la semana 24 de gestación; por ello no suele producirse hemólisis antes de esa fecha.

Las IgG se identifican mediante la prueba indirecta de antiglobulina (Coombs), o por potenciadores (albúmina, LISS, enzimas) y presentan efecto de dosis (reaccionan con mayor intensidad en células homocigotas que en heterocigotas). Los anticuerpos que producen EHRN con más frecuencia son anti-D y, en menor medida, anti-Kell.

Los anticuerpos ABO de tipo IgG que cruzan la placenta son una causa común de EHRN, generalmente con ictericia leve que cede con fototerapia; la incompatibilidad ABO puede ocurrir en el primer embarazo (a diferencia de la incompatibilidad Rh).

Control y prevención

A todas las mujeres, tras confirmarse un embarazo, se debe determinar el grupo ABO y Rh, incluyendo la búsqueda de D débil en los casos Rh negativos, además de un escrutinio de anticuerpos irregulares. Según los resultados:

• A las mujeres Rh negativas se debe administrar antiglobulina anti-Rh a las 28 semanas y otra dosis dentro de las 72 horas siguientes al parto si el recién nacido es Rh positivo; también en situaciones de riesgo (aborto, amniocentesis, traumatismo abdominal, etc.).
• Si se detecta un anticuerpo irregular hay que titularlo; si está elevado o en aumento puede requerir estudios fetales (amniocentesis, determinación de bilirrubina en líquido amniótico) y monitorización a lo largo de la gestación; en casos seleccionados puede requerirse transfusión intrauterina.
• Las técnicas moleculares permiten obtener ADN fetal de la circulación materna y conocer el genotipo RhD fetal, lo que ayuda a evitar pruebas o tratamientos innecesarios en fetos Rh negativos y a monitorizar fetos Rh positivos.

Anemias hemolíticas relacionadas con hemocompatibilidad

Las anemias hemolíticas se deben a la destrucción de los hematíes (hemólisis), con disminución de su vida media. Algunas están relacionadas con problemas de hemocompatibilidad:

Anemia hemolítica autoinmune (AHAI)

Se producen autoanticuerpos dirigidos contra antígenos de la membrana de los glóbulos rojos. La AHAI puede ser:

• AHAI por autoanticuerpos calientes: reactivos a 37 °C, predominantemente IgG.
• AHAI por autoanticuerpos fríos o crioaglutininas: reactivos a temperaturas inferiores a 37 °C, la mayoría IgM.
• Hemoglobinuria paroxística por frío: menos frecuente; anticuerpos IgG se unen a los GR a bajas temperaturas pero causan hemólisis a 37 °C cuando se completa la secuencia del complemento.

El origen inmune de la anemia hemolítica se demuestra por la presencia de anticuerpos y/o complemento en la membrana de los GR mediante la prueba de Coombs directa.

Técnicas para el estudio de la hemocompatibilidad

Técnicas de aglutinación

Principios:

• Para detectar un antígeno en un GR, se pone en contacto una suspensión de esos GR con el anticuerpo específico para ese antígeno.
• Para detectar un anticuerpo en plasma o suero, se pone en contacto una muestra de ese suero con GR que contengan el antígeno específico para ese anticuerpo.

Preparación de las muestras

Es necesario preparar adecuadamente la muestra de sangre: elaborar una suspensión celular con concentración adecuada y libre de elementos que puedan generar falsos positivos. También se requiere disponer de antígenos o anticuerpos específicos comercialmente disponibles.

Preparación de una suspensión de hematíes

Procedimiento básico a partir de sangre recogida en EDTA:

1. Centrifugar 5 min a 3.500 rpm.
2. Verificar ausencia de hemólisis y coágulos de fibrina; si hay fibrina, centrifugar de nuevo otros 5 min a 3.500 rpm.
3. Retirar el plasma sobrenadante con pipeta Pasteur, dejando la mínima cantidad de plasma.
4. Poner 0,2–0,5 ml de hematíes en un tubo de ensayo de 12 x 75 mm.
5. Agregar solución salina al 0,9% hasta 1 cm del borde, tapar e invertir suavemente para resuspender los hematíes.
6. Centrifugar 2 min a 3.500 rpm y decantar la salina.
7. Agregar un poco de salina y agitar para resuspender (lavado).
8. Repetir los pasos 5–7 hasta completar 3 lavados; en el último la salina debe quedar clara.
9. Agregar salina y ajustar la concentración de hematíes según la técnica requerida.

Aglutinación en tubo, placa y microplaca

Las metodologías clásicas son la aglutinación en tubo, en placa y en microplaca. A modo de ejemplo:

Técnica de aglutinación en placa (tipificación ABO)

1. Depositar en una placa una gota de suero anti-A, una de anti-B y una de anti-AB separadas entre sí.
2. Depositar una gota de hematíes problema en suspensión al 10% junto a cada antisuero y mezclar con varilla haciendo movimientos circulares hasta formar un círculo de 2–2,5 cm.
3. Aplicar un suave movimiento de rotación y observar si hay aglutinación. La presencia de aglutinación indica positividad para ese grupo.

Técnica de aglutinación en microplaca

Se usan microplacas comerciales con pocillos tapizados con anticuerpos; depositando las suspensiones de hematíes y tras incubación se observa aglutinación. Los pocillos positivos presentan un aspecto rojo uniforme; los negativos, un botón celular central. La identificación correcta del pocillo es esencial. La lectura puede ser visual o mediante lector de placas; permite automatización.

Técnica de aglutinación en tubo

1. Pipetear en un tubo una gota de antisuero y una gota de la suspensión de hematíes.
2. Mezclar, centrifugar 1 min a 1.000 rpm.
3. Visualizar la presencia de aglutinación dando suaves toques en la base del tubo; si no hay aglutinación los GR se resuspenden homogéneamente; en caso de aglutinación aparecen grumos.

En la lectura después de centrifugar: en reacción positiva los hematíes forman macroagregados en el fondo; en reacción negativa se resuspenden homogéneamente.

Aglutinación en columna de gel

La microtipificación en gel separa por tamaño los eritrocitos aglutinados mediante centrifugación en una columna de gel poroso. Los hematíes que no han reaccionado migran a través del gel hasta el fondo; los aglutinados quedan retenidos en la parte superior. Esta técnica se comercializa en tarjetas (p. ej. DG Gel®) y facilita la automatización y la lectura estandarizada.

Interpretación en tarjetas y sistemas automatizados

En tarjetas con pocillos, si el botón de hematíes queda en la parte superior indica aglutinación (positividad). La ausencia de hemólisis indica igualmente positividad. Si el botón se deposita en el fondo la lectura es negativa. En caso de discrepancia entre grupo sérico y hemático debe resolverse antes de informar el resultado.

Pruebas de hemocompatibilidad y muestras

Las pruebas de hemocompatibilidad buscan evitar la reacción hemolítica aguda; incluyen determinación de grupos ABO y Rh, detección de anticuerpos irregulares y pruebas cruzadas. Preferiblemente las muestras deben ser de sangre recién extraída.

Plazos aceptables para muestras pretransfusionales:

• Hasta 3 días antes si el paciente ha sido transfundido en los 3 meses anteriores o si la mujer ha tenido un embarazo en los 6 últimos meses.
• Hasta 5 días antes si el enfermo no ha sido transfundido en los 3 últimos meses y no ha tenido embarazo.

Determinación del grupo ABO

La tipificación ABO se hace de forma doble:

• Determinación directa (grupo celular): se usan anticuerpos anti-A y anti-B para detectar antígenos en los hematíes.
• Determinación inversa (grupo sérico): se usan hematíes reactivos A y B para detectar anticuerpos anti-A y anti-B en el suero.

Los dos resultados deben ser coherentes (por ejemplo, grupo celular A debe corresponder con grupo sérico anti-B). Los reactivos monoclonales actuales detectan también subgrupos débiles; discrepancias obligan a estudios adicionales.

Consideraciones generales en tipificación

• Los anticuerpos anti-A y anti-B del suero suelen necesitar centrifugación o incubación prolongada para aglutinar; se usan métodos en tubos, microplacas o columnas.
• En la determinación del grupo celular también se emplea antisuero anti-AB para detectar antígenos A o B débiles.
• El suero anti-AB incluye un anticuerpo que reacciona con antígenos A y B que producen individuos O y confiere mayor potencia.

Subgrupos A1 y A2

Se distinguen serológicamente con la lectina anti-A1 (Dolichos biflorus): las células A1 aglutinan con la lectina y las A2 no.

Discrepancias entre pruebas celular y sérica

Discrepancias por problemas de hematíes

• Antígeno A débil o ausente: no se detecta antígeno A, pero tampoco anticuerpo anti-A en suero como sería esperado.
• Antígeno B adquirido: pequeña cantidad de antígeno B y presencia de anticuerpos anti-B; ocurre en cáncer colorrectal, infección por bacterias gramnegativas u obstrucción intestinal.
• Glóbulos poliaglutinables: se detectan antígenos A y B y también anticuerpos anti-A o anti-B (el grupo sérico es correcto); fenómeno que puede tener causas in vivo o in vitro y requiere técnicas especiales.
• Campos mixtos: algunos hematíes aglutinan y otros no; puede deberse a transfusión reciente no isogrupo, quimerismo o subgrupos débiles.
• Anticuerpos esperados no presentes: ocurre en hipoagammaglobulinemias, edad avanzada o en neonatos; el Coombs directo negativo y el autocontrol deben alertar sobre posible antígeno débil.

Discrepancias por errores técnicos

Errores técnicos detectables a partir de discrepancias entre grupo celular y sérico incluyen:

• Antisueros mal conservados o no estandarizados.
• Muestra de sangre contaminada (olor desagradable, hemólisis); solicitar nueva muestra.
• Formación de rouleaux (pseudoaglutinación) por alteración albúmina/globulina; se diferencia añadiendo una gota de salina hipertónica (1,5%): si desaparece es pseudoaglutinación; si persiste, es aglutinación verdadera.
• Presencia de gelatina de Wharton en muestras de cordón umbilical: lavar células con salina calentada a 37 °C varias veces para retirarla.
• Autoanticuerpos y anticuerpos de reacción en frío: pueden interferir en la determinación inversa; se corrige incubando a 37 °C antes de leer los resultados.
• Técnica incorrecta: concentraciones celulares erróneas, centrifugación o incubación inadecuadas, o interpretación errónea de resultados.

Determinación del grupo Rh

Se determina el antígeno D mediante técnicas manuales, semiautomatizadas o automatizadas en tubos, microplacas o columnas de gel. Al no existir un control intrínseco como en ABO, se introduce un segundo tubo como control. La valoración se basa en la presencia o ausencia de aglutinación y en la intensidad (escala 0 a 4+).

Reactivos

Se usan sueros clasificadores o tarjetas de gel que contengan anti-D. Existen sueros de alto o bajo contenido proteico, de naturaleza IgM o mezclas IgM+IgG, y distintos diluyentes recomendados según composición del suero. Se deben seguir las instrucciones del fabricante y el procedimiento normalizado del laboratorio.

Determinación del genotipo Rh

Actualmente se puede determinar el genotipo por estudios genéticos, pero clásicamente se infiere a partir del fenotipo. Se enfrentan los hematíes con sueros anti-D, anti-C, anti-E, anti-e y anti-c, y a partir del patrón fenotípico se estima el genotipo probable.

Procedimiento básico para fenotipado Rh:

1. Rotular cinco tubos: D, C, E, c y e.
2. Añadir una gota de suspensión de hematíes a cada tubo y una gota del antisuero correspondiente.
3. Centrifugar 1 min a 1.000 rpm.
4. Observar aglutinación golpeando suavemente el fondo del tubo.
5. Interpretar el resultado y, a partir de la tabla de correspondencia fenotipo-genotipo, obtener el genotipo probable.

Detección de anticuerpos irregulares

Los anticuerpos aloinmunes contra antígenos eritrocitarios diferentes a los naturales del sistema ABO se denominan anticuerpos irregulares (Al). Aparecen:

• En respuesta a exposición a un antígeno eritrocitario extraño (transfusión o trasplante).
• Por incompatibilidad materno-fetal.
• En ocasiones sin estímulo identificable.

Los Al más frecuentes son: anti-Lea, anti-K, anti-E y anti-D. Si se detectan Al, se realiza un autocontrol (suero del receptor frente a sus propios eritrocitos):

• Autocontrol positivo: probable presencia de autoanticuerpos; hay que determinar si existen aloanticuerpos enmascarados.
• Autocontrol negativo: confirma que se trata de aloanticuerpos.

Técnicas para detección e identificación de anticuerpos irregulares

Se basan en aglutinación y pueden realizarse en tubo o en columna. Para detección se hace un screening enfrentando el suero con dos o tres suspensiones de hematíes de composición antigénica conocida. La presencia de aglutinación en al menos una suspensión y autocontrol negativo indica Al.

Para identificar el Al se usan paneles de hematíes (≈10–12 tipos) con composición antigénica conocida. Los paneles deben incluir antígenos clínicamente relevantes: D, C, E, c, e, M, N, S, s, P1, Lea, Leb, K, k, Fya, Fyb, Jka y Jkb.

El laboratorio debería disponer de células con expresiones homocigotas para antígenos clave (D, C, E, S, s, Fya, Fyb, Jka, Jkb) para confirmaciones. Las pruebas se realizan a temperatura ambiente, a 37 °C y con reactivo de Coombs (PAI) para detectar anticuerpos IgM e IgG, aglutinantes y no aglutinantes.

Pruebas cruzadas

Tras determinar grupos y anticuerpos irregulares, se realizan las pruebas cruzadas para asegurar compatibilidad entre la sangre seleccionada y el receptor. Se requieren muestras del donante y del receptor.

• Prueba cruzada mayor: detecta anticuerpos del receptor contra antígenos presentes en los hematíes donados. Usa suero del receptor y hematíes del donante.
• Prueba cruzada menor: detecta anticuerpos en el donante contra antígenos del receptor. Usa suero del donante y hematíes del receptor.

Es recomendable complementar las pruebas cruzadas negativas con una prueba de antiglobulina indirecta para descartar anticuerpos no aglutinantes. La automatización disminuye errores; en volúmenes pequeños pueden usarse sistemas manuales con control de calidad estricto.

Otras pruebas de compatibilidad

En transfusiones de concentrados de plaquetas (CP) o de plasma fresco congelado (PFC) puede ser relevante la presencia de anticuerpos en el donante. En CP se recomienda mantener identidad ABO cuando sea posible; la incompatibilidad (celular o sérica) reduce la supervivencia plaquetaria.

Compatibilidad plasmática

En PFC no se realizan pruebas de compatibilidad de manera rutinaria, pero hay que considerar ABO:

• Receptores O: pueden recibir PFC de cualquier grupo.
• Receptores A o B: deben recibir PFC de su grupo. Si no es posible, como segunda opción AB; otras opciones dependen del caso clínico.
• El PFC de grupo O es la última opción por el alto título de anticuerpos anti-A y anti-B en estos donantes.

Pruebas de la antiglobulina (test de Coombs)

Las pruebas de la antiglobulina consisten en reacciones de hemaglutinación empleando reactivo de Coombs (antisuero animal contra globulinas humanas y/o complemento). El reactivo puede ser:

• Monoespecífico: anti-IgG, anti-IgA, anti-IgM o anti-C3/C4.
• Poliespecífico: incluye anti-IgG y anti-C3.

Se pueden realizar en tubo, microplaca o columna de gel. Existen dos variantes: antiglobulina directa (PAD) e indirecta (PAI).

Prueba de antiglobulina directa (PAD)

En la PAD se enfrentan los eritrocitos del paciente con reactivo de Coombs; si existe anticuerpo o complemento unidos a la membrana eritrocitaria, se producirá aglutinación. Es útil para diagnosticar anemias hemolíticas autoinmunes y por fármacos, y también se usa en estudios de hematocompatibilidad (donantes y neonatos).

Procedimiento básico en tubo:

1. Preparar una suspensión de hematíes al 50% y lavar cuatro veces con solución isotónica (seis lavados en neonatos para eliminar gelatina de Wharton).
2. Colocar una gota de la suspensión en un tubo y añadir una gota de reactivo de Coombs.
3. Mezclar, incubar 2 min a temperatura ambiente.
4. Centrifugar 1 min a 1.000 rpm y observar aglutinación golpeando suavemente el fondo del tubo.
5. Todos los tubos negativos se someten a control de Coombs añadiendo una gota de hematíes sensibilizados comerciales y repitiendo la centrifugación; si el control no aglutina, el reactivo de Coombs está inactivo y la prueba queda invalidada.

La PAD puede dar positivos sin hemólisis (0,01–0,1% de donantes) y también falsos negativos si la cantidad de IgG en la membrana es demasiado baja.

Prueba de antiglobulina indirecta (PAI)

La PAI aumenta la sensibilidad de las pruebas de hemaglutinación clásica, permitiendo detectar complejos Ag-Ac cuando la cantidad de antígeno o anticuerpo es baja o cuando los anticuerpos no aglutinan. Es usada típicamente para detectar en suero materno inmunoglobulinas anti-Rh que pudieran provocar EHRN.

Procedimiento en dos pasos:

1. Incubar el suero (por ejemplo, materno) con hematíes Rh positivos. Si hay anticuerpos, se unirán a los hematíes (incubar a 37 °C para IgG).
2. Incubar la mezcla con reactivo de Coombs; si los hematíes estaban recubiertos por anticuerpos, se producirá aglutinación.

Los tubos negativos se someten a control de Coombs con hematíes sensibilizados, como en la PAD.

Para la detección e identificación de anticuerpos irregulares conviene llevar las incubaciones hasta la PAI para asegurar la detección de anticuerpos no aglutinantes (p. ej. Duffy).

Test de Donath-Landsteiner

Se utiliza para diagnosticar la hemoglobinuria paroxística por frío (anticuerpos bipolares). Procedimiento básico:

1. Extraer dos muestras de sangre en tubos sin anticoagulante y mantener en baño a 37 °C 10 min.
2. Centrifugar 10 min a 3.000 rpm y separar el suero.
3. Preparar cuatro tubos numerados 1–4; depositar en cada uno dos gotas de suero del paciente y dos gotas de una suspensión de eritrocitos O.
4. Añadir al tubo 4 dos gotas de suero normal fresco como fuente de complemento.
5. Incubaciones:

• Tubo 1: en hielo (0 °C) 90 min.
• Tubo 2: a 37 °C 90 min.
• Tubo 3: 0 °C 30 min, luego 37 °C 60 min.
• Tubo 4: 0 °C 30 min, luego 37 °C 60 min (con complemento).

Centrifugar los tubos 10 min a 3.000 rpm y observar el sobrenadante en busca de hemólisis.

La prueba es positiva cuando hay hemólisis en los tubos 3 y 4, y no en los tubos 1 y 2.