Tecnologías de secuenciación de DNA de segunda y tercera generación

Resumen

El documento describe las principales tecnologías de secuenciación de DNA de segunda generación, como la pirosecuenciación, la secuenciación por síntesis de Illumina y Ion Torrent. También explica los métodos de tercera generación, entre ellos SMRT PacBio y Oxford Nanopore, y sus diferencias de funcionamiento y de longitud de fragmento que pueden procesar.

Puntos clave

La pirosecuenciación detecta la luz emitida al liberarse pirofosfato, que se une a la luciferasa; la intensidad es proporcional al número de nucleótidos incorporados.
La pirosecuenciación procesa fragmentos pequeños y permite pocas secuenciaciones simultáneas, por lo que es muy útil para secuenciar bacterias.
Illumina añade un nucleótido por ciclo, detecta la fluorescencia de cada color y permite la secuenciación Paired-end.
Ion Torrent detecta cambios de voltaje provocados por los protones liberados durante la polimerización.
Los métodos de tercera generación secuencian DNA sin amplificación por PCR, usando una cantidad mínima de DNA.
SMRT PacBio permite leer fragmentos largos varias veces y reconoce el nucleótido según la velocidad de la DNA polimerasa.
Oxford Nanopore hace pasar el DNA por un microporo en una membrana y detecta cada nucleótido por el cambio de polaridad.

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Tecnologías de Secuenciación de Segunda Generación

Pirosecuenciación

En la amplificación se genera luz visible mediante la detección de pirofosfato. La intensidad de la luz es proporcional al número de nucleótidos incorporados. La detección se realiza al añadir nucleótido a nucleótido; al incorporarse, se libera pirofosfato, que se une a la luciferasa y emite luz, la cual es detectada por un sensor. Se utiliza poco debido a que el tamaño de fragmento que puede procesar no es muy grande y no permite realizar muchas secuenciaciones simultáneas. Es, sin embargo, muy útil para secuenciar bacterias.

Secuenciación por Síntesis (Illumina)

Se realiza paso a paso, añadiendo un solo nucleótido en cada ciclo, incluso en casos de homopolímeros. Es necesario realizar lavados frecuentes. Se añade un nucleótido y se detecta la fluorescencia emitida (identificando el punto de la placa donde ocurre). Cada nucleótido emite fluorescencia de un color específico. Permite la secuenciación por ambos extremos (Paired-end), lo cual facilita el ensamblado.

Ion Torrent

El sensor determina la incorporación del nucleótido mediante la detección de cambios de voltaje. Al polimerizar, se liberan protones que son detectados por un sensor. Al igual que en otros métodos, se añade nucleótido a nucleótido.

Métodos de Tercera Generación

Representan el NGS Workflow simplificado. Tras la preparación de librerías, se procede directamente al secuenciado sin necesidad de amplificación. Se intenta secuenciar utilizando una cantidad mínima de DNA (sin realizar amplificación por PCR), eliminando así algunos de los problemas asociados a la segunda generación.

SMRT PacBio

Permite secuenciar fragmentos de mayor tamaño, donde cada fragmento es leído varias veces. Los pasos son:

1. Generar amplicones.
2. Ligar adaptadores: para formar un plásmido monocatenario.
3. Secuenciar: se añade DNA polimerasa de ciclo rodante, secuenciando varias veces el mismo fragmento.
4. Procesamiento de datos: mediante la velocidad de la DNA polimerasa, es posible identificar el nucleótido que se está secuenciando.

Oxford Nanopore

Sistema basado en una membrana que contiene una proteína unida, la cual crea un microporo que permite que el DNA atraviese la membrana nucleótido a nucleótido. Dependiendo del nucleótido que atraviese el poro, la polaridad de la membrana cambia, permitiendo su detección.

Preguntas frecuentes

¿Qué diferencia hay entre la secuenciación de segunda y de tercera generación?

Las tecnologías de segunda generación requieren amplificación previa del DNA mediante PCR, mientras que las de tercera generación intentan secuenciar con una cantidad mínima de DNA sin amplificar. Además, las de tercera generación pueden procesar fragmentos de mayor tamaño.

¿Cómo funciona Oxford Nanopore?

Usa una membrana con una proteína unida que forma un microporo por el que el DNA pasa nucleótido a nucleótido. Según el nucleótido que atraviesa el poro, cambia la polaridad de la membrana y así se detecta.

¿Para qué se usa la pirosecuenciación?

Se utiliza poco porque procesa fragmentos pequeños y no permite muchas secuenciaciones simultáneas, pero es muy útil para secuenciar bacterias.