Tècniques de Diagnòstic: ELISA, RT-PCR i qPCR

L'ELISA: Immunoassaig Enzimàtic

L'ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) és un immunoassaig enzimàtic basat en la interacció específica antigen–anticòs. S’utilitza per detectar i quantificar antígens o anticossos en mostres biològiques complexes com la sang, l’orina o la saliva.

El principi consisteix a immobilitzar un dels components (antigen o anticòs) en una placa i fer que l’altre estigui marcat directament o indirectament amb un enzim (com la peroxidasa de rave picant o la fosfatasa alcalina). Després de la unió específica Ag–Ab i dels rentats per eliminar els components no units, s’afegeix un substrat que l’enzim transforma en un producte detectable (colorimètric, fluorescent o quimioluminiscent), i la intensitat del senyal és proporcional a la concentració de l’analit (o inversament proporcional en el cas del format competitiu).

Formats i Aplicacions de l'ELISA

Hi ha diferents formats d’ELISA:

• Directe
• Indirecte
• Sandvitx
• Competitiu

És una tècnica molt sensible i específica, àmpliament utilitzada en diagnòstic clínic per mesurar hormones, marcadors tumorals, detectar infeccions o drogues d’abús.

RT-PCR, qPCR i Sondes Utilitzades

La PCR és una tècnica d’amplificació de DNA que permet detectar seqüències específiques a partir de quantitats molt petites de material genètic. Quan l’analit és RNA, primer cal convertir-lo en DNA complementari mitjançant una transcriptasa inversa; aquest procés s’anomena RT-PCR (Reverse Transcription PCR).

La qPCR (PCR quantitativa o en temps real) permet no només detectar sinó també quantificar la quantitat inicial de DNA o cDNA, ja que la formació del producte s’observa cicle a cicle mitjançant un senyal fluorescent. Quan es combinen ambdues etapes es parla de RT-qPCR, que és la tècnica de referència per quantificar l’expressió gènica o la càrrega viral.

Funcionament de les Sondes en qPCR

Les sondes utilitzades són fragments monocatenaris de DNA o RNA complementaris a la seqüència diana, marcats per poder detectar la hibridació. En qPCR s’utilitzen principalment:

• Sondes fluorescents específiques
• Colorants intercalants que emeten fluorescència quan s’uneixen al DNA de doble cadena

D'aquesta manera, el senyal augmenta amb l’amplificació. La detecció es basa en la hibridació específica de la sonda amb la seva seqüència complementària, cosa que proporciona una elevada sensibilitat i selectivitat.