Técnicas de PCR, Hibridación y Marcaje Molecular: Fundamentos y Aplicaciones en Biología Molecular

Técnicas de PCR

PCR anidada: consiste en la realización de dos PCR acopladas. La segunda utiliza como ADN molde los productos de amplificación de la primera. Se emplea para aumentar la sensibilidad de la PCR.

PCR múltiple: amplifica varias secuencias diana simultáneamente en el mismo tubo, con una sola reacción de PCR y varios cebadores. Los cebadores no deben hibridar entre sí, presentan una temperatura de anillamiento similar y cada pareja amplifica una única secuencia diana, generando amplicones de tamaño diferente.

RT-PCR (transcripción inversa): permite amplificar moléculas de ARN. La técnica requiere realizar una síntesis de ADNc mediante transcripción inversa y, posteriormente, usar ese ADN como molde para replicarlo con una ADN polimerasa termoestable.

PCR en tiempo real (qPCR): monitoriza la amplificación mediante fluorescencia. El amplicón se detecta ciclo a ciclo, lo que la hace más rápida. Se distinguen la zona de ruido, la fase exponencial y la fase de meseta. El Ct (ciclo umbral) es el ciclo en el que la cantidad de amplicón no es suficiente, por lo que está por debajo del límite de detección. Los colorantes habituales son SYBR y las sondas TaqMan.

PCR in situ: se realiza directamente sobre un corte de tejido sin extraer el ADN. El producto de PCR se detecta por marcaje directo o indirecto con moléculas fluorescentes.

PCR asimétrica: amplifica preferentemente una de las dos hebras. Es de tipo lineal, utiliza un único oligonucleótido y tiene aplicación en la secuenciación por el método de Sanger.

PCR digital: permite la cuantificación absoluta de ácidos nucleicos. La muestra se divide en miles de subreacciones y se somete a PCR, cuantificación de ácidos nucleicos y lectura de cada partición.

Clonación molecular: se realiza en células vivas y permite amplificar millones de pares de bases. Es un procedimiento manual y ofrece una cantidad ilimitada de la secuencia de interés.

Componentes de la reacción de PCR

Reacción:

• Cebador: oligonucleótido monocatenario cuya secuencia es complementaria a la región que flanquea la secuencia diana.
• ADN polimerasa: enzima que actúa a temperatura alta.
• Mezcla de reacción: contiene tampón con Cl₂Mg, necesario para que la Taq funcione; desoxirribonucleótidos trifosfato (dNTP) y el ADN molde, que contiene la secuencia de interés.

Master mix: se ajusta el volumen del master mix, restando el ADN molde, ya que hay que pipetear poco y así se evita la contaminación. Se incluyen un control positivo (con ADN) y un control negativo (master mix más agua).

Hibridación molecular y sondas

Secuencia diana: secuencia concreta de bases que se quiere detectar.

Sonda: cadena nucleotídica cuya secuencia de bases es complementaria a la secuencia diana.

Tm (temperatura de fusión): para moléculas de menos de 500 pb aumenta con la longitud de la cadena; para más de 500 pb está determinada por la proporción GC. En moléculas grandes, cuanto mayor es el contenido en GC, mayor es la Tm.

Factores que influyen en la velocidad de renaturalización: la concentración de ADN (a mayor concentración, mayor número de copias y mayor velocidad) y el tiempo (a más tiempo, más posibilidades de hibridación). En la renaturalización influye la concentración de ADN; en la desnaturalización, la composición de las bases.

Factores que afectan a la hibridación de ADN

• Fuerza iónica: los cationes aumentan la Tm (curva hacia la derecha).
• Agentes desnaturalizantes: como el DMSO, disminuyen la Tm (curva hacia la izquierda).
• Mismatch: a mayor número de mismatches, menor Tm.

Tipos de sonda

Sonda de ADN:

• Sintetizadas químicamente: pequeñas, monocatenarias y de poca sensibilidad (usadas en FISH).
• Tecnología de ADN recombinante: grandes, más específicas y sensibles; deben desnaturalizarse.
• PCR: de tamaño intermedio, muy utilizadas.

Sonda de ARN: ribosondas, monocatenarias. Se obtienen por síntesis química o por transcripción.

Marcajes

• Isótopo radiactivo: emite radiación que se visualiza por autorradiografía (fósforo 32 y tritio; se usa en blot).
• Fluorocromo: emite luz al ser excitado por luz UV (cianinas, familia Alexa, FISH).
• Hapteno: molécula pequeña que se acopla a la sonda y debe ser detectada mediante un método indirecto de revelado (digoxigenina y biotina).

Técnicas de marcaje

• Desplazamiento de mella (nick translation): marca ADN bicatenario de gran tamaño con isótopos radiactivos o haptenos; se añade una mezcla de cebadores, ADN polimerasa y dNTP.
• Terminal: para ADN bicatenario o monocatenario de pequeño tamaño; existen 3 tipos, con la enzima TdT y dNTP.
• PCR: para fragmentos bicatenarios de tamaño intermedio; se emplean dNTP marcados.
• ARN: se transcribe a partir de ADN, con 3 marcadores de dNTP y ARN polimerasa.

Fases de la hibridación

Preparación de la muestra sobre soporte, hibridación, lavado y detección del híbrido.

Detección del híbrido

• Marcador radiactivo: sobre soporte, se detecta por autorradiografía; la positividad se observa como marcas negras.
• Fluorocromo: en situ, mediante microscopía de fluorescencia; imagen brillante.
• Hapteno: válido para todo tipo de técnicas; se detecta mediante métodos inmunohistoquímicos con un anticuerpo antihapteno.

Técnicas de hibridación sobre soporte

Soporte sólido: la secuencia diana se inmoviliza en un soporte previo a la hibridación.

Medio líquido: la hibridación se forma en solución y, posteriormente, se fija en la pared.

In situ: se realiza directamente sobre extensiones citológicas.

Dot blot

Utiliza membranas de nitrocelulosa como soporte. Detecta ADN o ARN, permite analizar varias muestras a la vez y emplea sondas con hapteno. Se aplican las muestras sobre el soporte, se realiza el preshibridación, la hibridación, el lavado y la detección con sonda radiactiva o con hapteno.

ASO dot blot (oligonucleótidos alelo-específicos): se inmoviliza la muestra en la membrana. Sirve para detectar variantes alélicas, mutaciones puntuales, con hibridación con oligonucleótidos específicos de sonda.

Dot blot inverso: se utiliza cuando el gen presenta un número alto de variantes alélicas; se inmovilizan en la membrana los oligonucleótidos específicos y se identifica la mutación del gen.

Southern blot

Identifica fragmentos de ADN separados mediante electroforesis en gel y transferidos a una membrana de nitrocelulosa. Incluye digestión enzimática, electroforesis en gel de agarosa, transferencia a membrana, hibridación y revelado.

Northern blot

Detecta fragmentos de ARN separados por electroforesis en gel y transferidos a membrana. No requiere digestión porque el ARN es puro.

Microarrays

Son conjuntos de ADN o ADNc inmovilizados sobre un chip. Cada chip contiene miles de fragmentos de ADN. Las sondas son monocatenarias y no marcadas, que se marcan con fluorocromo. Con los puntos se detectan enfermedades. El proceso incluye marcaje, hibridación, lectura y análisis.

Array de hibridación genómica comparada: las deleciones se representan en rojo, las duplicaciones en verde, la unión de ADN paciente y de referencia en amarillo (partes iguales), y el ADN paciente no alterado.

Expresión génica: rojo indica gen reprimido (debería expresarse), marrón indica sobreexpresión.

Captura de híbridos en fase líquida

Se forman híbridos capturados por una sonda específica; la captura ocurre porque los anticuerpos están en los pocillos de una placa de microtitulación. Permite determinar el VPH.

Hibridación in situ (ISH)

La secuencia diana se localiza en el sitio fisiológico.

FISH (hibridación in situ con fluorescencia)

Utiliza sondas marcadas con fluorocromo y se realiza sobre cromosomas en metafase (hibridación, lavado, contratinción y visualización).

FISH en interfase

Analiza secuencias de ADN en núcleos en interfase. Tipos de sonda:

• Sonda centromérica: hibrida con secuencias localizadas en el centrómero; útil para aneuploidías y poliploidías.
• Sonda específica de locus: hibrida con una región específica del cromosoma; detecta anomalías numéricas.

Las sondas de locus pueden ser:

• Split (separación): se sabe que el cromosoma pierde el fragmento, pero no dónde va; se utilizan sondas de color rojo, amarillo y verde.
• Fusión: si se conocen los dos cromosomas implicados, se usan dos pares de sondas; se ven dos puntos de cada color.
• Fusión translocación recíproca: 1 verde, 1 rojo y 2 amarillos.

FISH en metafase

Detecta secuencias de ADN en el cromosoma usando sondas centroméricas y de locus específico; ambas identifican el cromosoma donde se encuentra el locus.

• Sonda telomérica: hibrida con las regiones teloméricas; detecta deleciones.
• Técnica especial (pintado de cromosomas): la sonda hibrida con el cromosoma completo; se utiliza para translocaciones.

FISH multicolor

Coctel de sondas marcadas con fluorocromos con solapamiento parcial; detecta anomalías estructurales.

Cariotipo espectral (SKY)

Combina FISH multicolor con pintado cromosómico mediante sondas WCP (coctel de 24) y fluorocromos; se utiliza en células tumorales.

Hibridación genómica comparada

Cromosomas en metafase, con microscopía de fluorescencia; detecta deleciones y duplicaciones de varias megabases.

CISH (hibridación in situ cromogénica)

Utiliza una reacción inmunohistoquímica que produce color; se emplea en la detección de virus sobre secciones de tejidos incluidos en parafina (FFPE). Incluye desparafinado y rehidratación, digestión enzimática, preshibridación, hibridación, lavado, detección con hapteno, contratinción con hematoxilina y observación. Ventajas: sonda estable y observación con microscopio óptico. Inconvenientes: requiere patólogo experto y más tiempo.