Técnicas de Ionización en Espectrometría de Masas

· Sistemas de entrada por sonda directa: Permiten introducir líquidos y sólidos volátiles en pequeñas cantidades (incluso poco volátiles o termolábiles)

Sistemas de entrada por Ablación láser: Se utiliza para sublimar muestras sólidas que son difíciles de digerir químicamente: cerámicas, vidrios y sustancias resistentes a ácidos. El láser pulsado calienta la superficie y desprende parte de la muestra. El material eliminado en forma de pequeñas partículas se conduce a la fuente de iones del MS mediante el flujo de un gas inerte.

· Sistemas de entrada continua de muestra: Infusión // Inyección directa en flujo // Inyección directa por separación.

FUENTES DE IONIZACIÓN:

En la Fuente de Iones se crean o desorben iones

El aspecto de un espectro de masas depende en gran medida del método utilizado para la formación de los iones. Las fuentes de iones pueden ser duras o blandas:

- Las fuentes duras comunican energías elevadas a los iones formados produciendo una gran fragmentación de los mismos -> Espectros complejos con gran información estructural.

- Las fuentes blandas comunican bajas energías a los iones formados produciendo muy poca o nula fragmentación -> Espectros sencillos que permiten determinar la fórmula molecular.

La elección de la fuente de iones dependerá de la naturaleza de las moléculas analizadas: masa molecular, polaridad, solubilidad, volatilidad y estabilidad térmica

Fuentes de fase gaseosa:

el proceso de ionización se realiza sobre una muestra previamente evaporada.

§ Moléculas volátiles: (térmicamente estables a Tª < 500ºC -> Moléculas apolares con pesos moleculares < 500 Da

§ Dura: EI // Blandas: CI y APcI

Fuentes de desorción:

El proceso de ionización se realiza directamente sobre una muestra sólida o líquida, prescindiendo de su vaporización previa.

§ Moléculas no volátiles y termolábiles -> Moléculas con cierta polaridad con pesos moleculares < 500 kDa ; Biomoléculas (especies bioquímicas delicadas)

§ Muy blandas: MALDI y ESI

IONIZACIÓN POR IMPACTO ELECTRÓNICO (EI) (M+)

1ª fuente de ionización descrita para MS (1919)

El bombardeo de moléculas neutras gaseosas con electrones (desde filamentos incandescentes y se aceleran entre electrodos de hasta 70v. Pasan a través de una apertura que colima el haz antes de atravesar el vapor de la muestra, es decir se forma un haz de iones monoenergético que colisionará con las moléculas del analito) de elevada energía produce iones moleculares. La colisión entre los electrones energéticos y las moléculas de analito proporcionan a estas suficiente energía interna residual para dejarlas en estados vibracionales y rotacionales excitados que producen la fragmentación.

IONIZACIÓN QUÍMICA (CI) (MH+)

La Ionización Química (1965) tiene lugar por colisión de las moléculas neutras gaseosas de la muestra con iones de un gas reactivo (gas reactivo como mediador para suavizar las condiciones de ionización de la muestra. Se introduce el gas reactivo en la cámara de ionización a unos 10^-3 torr. Su [ ] es mayor que que la de la muestra.), cuya ionización se ha originado por impacto electrónico, produciendo iones quasimoleculares.

(El analizador esta a vacío. Para eliminar esta dificultad de potencial se utiliza una bomba de alto vacío para evacuar la región entre la fuente de ionización y el analizador de masas.

Gas Reactivo

CH4 + e- → CH4+• + 2 e-

CH4+• + CH4 → CH5+ + CH3•

CH4+• → CH3+ + H•

CH3+ + CH4 → C2H5+ + H2

Reacciones Químicas

CH5+ + M → CH4 + MH+

C2H5+ + M → M(C2H5)+

CH4+• + M → CH4 + M+•

C2H5+ + MH → C2H6 + (M-H)+

IONIZACIÓN QUÍMICA A PRESIÓN ATMOSFÉRICA (APcI) [M+H]+ // (M-H)-

Los iones gaseosos se forman a partir de reacciones químicas en fase gaseosa de las moléculas neutras del analito con iones reactivos del disolvente.

Inyectas líquido que pasa por un nebulizador en el que se inyecta N2 y se forma un aerosol que mediante un electrodo de descarga se produce la formación de reactivo cargado a 3/5 kV y este transfiere la carga al analito formándose iones de analito.

MeOH + e -> [MeOH] + + 2 e

[MeOH] + MeOH -> [MeOH2]+ + MeO-

IONIZACIÓN POR DESORCIÓN CON LÁSER ASISTIDA POR MATRIZ (MALDI)

La gran utilidad de las técnicas MALDI (1987) es su capacidad para analizar macromoléculas de pocos miles (péptidos) a cientos de miles de Da (proteínas)

1. La muestra se dispersa en una matriz (104- 107:1) con la ayuda de un disolvente adecuado y se coloca en una placa. Se deja secar y una vez evaporado el disolvente se produce la cristalización del analito con la matriz. La función de la matriz es:

- Aislar las moléculas de analito entre sí y rodearlas de un gran nº de moléculas de matriz.

- Absorber gran parte de la energía del láser evitando que se degraden las moléculas de analito.

- Actuar como dador o receptor de protones durante la ionización del analito.

El disolvente utilizado debe solubilizar tanto la matriz como la muestra y permitir la cocristalización

de la matriz con el analito de forma homogénea.

1. La ionización se produce por la energía de un pulso láser (IR o UV) que ioniza a la matriz y transmite la carga al analito, provocando a su vez la desorción de la matriz arrastrando consigo al analito.

El punto caliente debe ser de muy corta duración para evitar la descomposición térmica.

La longitud de onda del láser utilizado debe ser adecuada para conseguir la excitación electrónica (láser UV) o vibracional (láser IR) de la matriz.

IONIZACIÓN POR ELECTRONEBULIZACIÓN (ESI)

“Ionización en fase líquida” La “Electronebulización” expulsa hacia la fase gaseosa iones preexistentes en disolución, pero no crea nuevos iones. El control del pH ayuda a que las especies ionizables se encuentren en su forma aniónica o catiónica. Asimismo, especies neutras polares pueden protonarse o asociarse a iones presentes en la fase móvil y especies neutras menos polares pueden sufrir reacciones de oxidación/reducción a la salida del capilar de la sonda.

(A partir de una disolución que fluye a través de una aguja hueca sometida a un campo eléctrico de 5-10 Kv/cm, se forman gotas pequeñas cargadas eléctricamente. La aguja tiene dos flujos concéntricos. El interior lleva la muestra. El exterior es un segundo líquido que se mezcla con la muestra, y puede modificar el contenido de iones, y ayuda a producir un buen contacto eléctrico con el metal. Por último, uno de los diseños tiene un tercer fluido que suele ser un portador gaseoso que ayuda a la formación de gotas. Las gotas son de 1um de diámetro y tienen una carga neta que hace que sean atraídas a un electrodo a través de un volumen abierto. Las gotas se mueven a contracorriente en ese volumen, que evapora parte del disolvente - un proceso llamado desolvación. Como consecuencia, las gotas se recogen y los iones que se encuentran en la superficie se ven forzados a aproximarse entre sí. En cierto momento, la repulsión de los iones se hace mayor que la tensión de la superficie que mantiene unidas las gotas en forma esférica, y las pequeñas gotas se rompen. (El punto donde se pronostica que las gotas se rompen se llama el límite de Rayleigh, pero la ruptura se suele producir antes de que se alcance dicho punto) El proceso completo se llama evaporación de iones.)

Fuentes API complementarias

ESI:

- La técnica de ionización muy suave, ideal para compuestos termolábiles.

- Indicada para compuestos con cierta polaridad (de baja-media a muy alta polaridad) que se puedan ionizar en disolución.

- Interfase con mayor sensibilidad y aplicabilidad (más del 90%).

- La formación de iones con múltiples cargas permite el análisis de compuestos de muy elevado peso molecular.

APcI

- Requiere compuestos con una cierta volatilidad (NO termolábiles).

- Indicada para compuestos de baja a media polaridad.

- NO se requiere que los analitos estén ionizados en disolución.

- Buena sensibilidad para compuestos de polaridad y peso molecular intermedios.

- Complementaria a ESI para el análisis de compuestos poco polares.

ESI vs. APcI: Factores que afectan a la señal del analito

• La concentración del analito

ESI. La señal se llega a saturar (≈ 10 μM).

APcI. No hay efecto.

• La Matriz

ESI. La señal disminuye con el aumento de la concentración

de otros electrolitos (“supresión iónica” ).

APcI. No hay efectos importantes.

• El flujo de fase móvil

ESI. La respuesta disminuye con el flujo.

Flujos óptimos: 0.1- 0.2 mL/min.

APcI. Necesita flujos altos (0.5 – 1 mL/min)

Formación de Aductos

ESI+: Forman habitualmente aductos de Na+ (M+23), K+ (M+39) o NH4+ (M+18)

APCI+: Se pueden formar aductos con NH4+, pero NO con Na+ o K+

ESI/APCI: Es posible la formación de aductos con un anión procedente del eluyente: HCOO-, CH3COO-, Cl-, …

Formación de Clusteres

ESI+: Es posible la formación de aductos con disolvente: [MH+CH3CN]+, [MNa+CH3CN]+, [MH+CH3OH]+, [MH+H2O]+, …