Técnicas de Inmunoensayo: Fundamentos de ELISA y CEDIA en el Laboratorio Clínico

Sandwich ELISA

Este método busca la detección de antígenos (Ag). El procedimiento consiste en utilizar un anticuerpo (Ac) fijado a una fase sólida. Se incuba la muestra problema que contiene el antígeno que buscamos con dicho anticuerpo; posteriormente, se realiza un lavado para eliminar el resto de los componentes de la muestra. Se añade un anticuerpo conjugado con una enzima (Ac*enz), el cual se une al antígeno por otro determinante antigénico, formando así el complejo tipo sandwich. Se vuelve a incubar y se realiza otro lavado para eliminar el exceso de anticuerpo marcado. Finalmente, se añade el sustrato a la enzima y se mide mediante espectrofotometría; la medida obtenida es equivalente a la concentración ([]) de antígeno en la muestra problema.

ELISA de Captura

Esta técnica busca la detección de anticuerpos (Ac). Emplea un anticuerpo anti-Ig humana fijado a la fase sólida. Se incuba la muestra con los anticuerpos en los pocillos fijados para formar complejos inmunes, mientras que el resto de los componentes se eliminan por lavado. Luego, se añade el antígeno específico para el anticuerpo buscado, se incuba y se lava. Posteriormente, se añade un anticuerpo específico para el antígeno anterior (marcado con enzima) y se adiciona el sustrato para la enzima. Esto produce una reacción de color que es equivalente a la concentración de anticuerpos presente en la muestra problema.

ELISA Competitivo (Ag*enz)

Su objetivo es buscar antígenos en la muestra. Se utiliza un anticuerpo fijado en el pocillo (fase sólida) y se añade la muestra problema con el antígeno, junto con ese mismo antígeno marcado con enzima (Ag*enz). Se produce una competencia entre los dos antígenos por la unión con el anticuerpo. Tras lavar lo que no se ha unido, se añade el sustrato. El color producido es inversamente proporcional a la concentración de antígeno en la muestra (a más antígeno en la muestra, menor intensidad de color).

ELISA Competitivo (Ac*enz)

Este método busca la detección de anticuerpos. Se utiliza un antígeno fijado a la fase sólida y un anticuerpo marcado con enzima (Ac*enz), el cual puede unirse al antígeno fijado o quedar libre. Se añade la muestra problema (con o sin anticuerpos) y el sustrato de la enzima. La unión del anticuerpo marcado a los antígenos fijados se muestra a través de la actividad enzimática, la cual es inversamente proporcional a la concentración de antígenos en la muestra. (Más antígeno en la muestra → menos anticuerpo marcado en la placa → menos color).

SPIA sobre Membrana

Utiliza una membrana (MB), como la de nitrocelulosa, para mejorar la rapidez y la sensibilidad del ELISA, facilitando la separación y el lavado de los complejos antígeno-anticuerpo. Se emplea frecuentemente para detectar bacterias como el Streptococcus beta-hemolítico de los grupos A y B.

CEDIA (Inmunoensayo de Donador con Enzima Clonada)

Es un inmunoensayo homogéneo competitivo. Utiliza la enzima beta-galactosidasa fraccionada en dos partes inactivas: una aceptora grande y otra donadora de menor tamaño unida al antígeno a determinar. La combinación de ambas partes da lugar a la enzima activa. Si el anticuerpo se une al antígeno del fragmento donador, bloquea la unión de los dos fragmentos y no se activa la enzima. Existe una competencia entre el antígeno de la muestra y el antígeno ligado a la fracción donadora por unirse al anticuerpo. Cuando hay mucho antígeno libre en la muestra, este se une al anticuerpo, dejando libre el fragmento donador para juntarse con el fragmento aceptador y formar la beta-galactosidasa activada. La enzima cataliza una reacción que genera una señal, la cual es proporcional (+ antígeno en muestra + unión al anticuerpo + enzima formada).