Técnicas de hibridación en soporte sólido, líquido e in situ

1. Qué son y cómo se hacen las técnicas de hibridación en soporte sólido.

• Las técnicas de hibridación en soporte sólido se caracterizan porque una de las dos moléculas implicadas, la secuencia diana o la sonda, se inmovilizan sobre un soporte sólido previo a la hibridación.

• Lo habitual es fijar al soporte la muestra que contiene la secuencia diana e incubar posteriormente con la sonda marcada para formar el híbrido.

2. Qué son y cómo se hacen las técnicas de hibridación en soporte líquido.

• En las técnicas de hibridación en medio líquido, el híbrido sonda/secuencia diana se forma en solución, normalmente en pocillos de una placa microtiter, y posteriormente se fija a la pared del pocillo para proceder a su detección.

• Su realización es similar a la de los inmunoensayos tipo ELISA, en estas técnicas no se marca ni la sonda ni la muestra.

3. Qué son y cómo se hacen las técnicas de hibridación in situ.

• Las técnicas de hibridación in situ son las técnicas en las que la hibridación de los ácidos nucleicos se realiza directamente sobre extensiones citológicas o secciones de tejido y el resultado obtenido se analiza microscópicamente en el contexto de detalles morfológicos.

4. Dependiendo del marcador, ¿qué dos técnicas de hibridación in situ existen?

• Hibridación in situ fluorescente (FISH): las sondas se marcan con fluorocromos. (se requiere microscopio de fluorescencia).

• Hibridación in situ cromogénica (CISH): las sondas se marcan con haptenos. Los híbridos se detectan por métodos inmunohistoquímicos, produciéndose al final una reacción coloreada que se visualiza con un microscopio óptico normal.

5. Qué es y cómo se hace la técnica Dot blot.

• Es una técnica de hibridación simple que utiliza membranas de nitrocelulosa o nylon como soporte sólido y que permite detectar secuencias de ácidos nucleicos, ADN o ARN, en una mezcla compleja, sin aportar ninguna información adicional.

• Genéricamente se comienza con la aplicación de la muestra a la membrana y se continúa con la prehibridación, hibridación, lavado de post hibridación y detección del híbrido.

6. ¿Qué es lo permite esta técnica?

• Esta técnica permite el estudio simultáneo de varias muestras, aplicando cada muestra en una zona distinta de la membrana y se puede realizar con sondas radiactivas o con sondas marcadas con haptenos.

7. Qué es y cómo se hace la técnica Southern blot.

• Es una técnica de hibridación que permite identificar fragmentos de ADN separados por electroforesis en gel y transferidos a una membrana de nitrocelulosa o nylon.

8. ¿Qué es lo que permite esta técnica a diferencia del Dot blot?

• A diferencia del dot blot, permite la detección simultánea de varias secuencias diana de distintos tamaños con una única hibridación.

9. Enumera las diferentes partes de un protocolo habitual de Southern blot.

• Digestión enzimática.
• Electroforesis en gel.
• Transferencia del ADN a la membrana.
• Hibridación.
• Revelado.

10. Enumera los tres pasos de la desnaturalización en el Southern blot.

• Desnaturalización alcalina con una solución de hidróxido sódico.
• Neutralización con un tampón a pH neutro.
• Lavado del gel con solución de lavado (SSPE).

11. En esta técnica, ¿qué es preferible hacer cuando se trabaja con ADN genómico?

• Cuando se trabaja con ADN genómico es preferible digerir toda la noche con un exceso de enzima.

12. ¿Cuánto tiempo se necesita para digerir un plásmido?

• Para digerir un plásmido clonado suele ser suficiente una incubación de 1-2 horas.

13. Qué es y cómo se hace la técnica Northern blot.

• Es una técnica de hibridación qué permite detectar moléculas de ARN separadas por electroforesis en gel y transferidas a una membrana de nitrocelulosa o nylon.

14. Cuáles son las tres diferencias principales del Northern blot respecto al Southern blot. Explícalas.

• No requiere digestión enzimática previa con enzimas de restricción.
• La electroforesis se realiza en condiciones desnaturalizantes. Las moléculas de ARN en solución tienden a adquirir estructuras secundarias.
• No es necesario el paso de desnaturalización antes de la transferencia del gel a la membrana.

15. Cuáles son las principales aplicaciones del Northern blot. Explícalas.

• El análisis de expresión génica.
• La detección de mutaciones.
• Estudios de corte y empalme o splicing alternativos.

16. Define qué son los microarrays.

• Los microarrays de ADN son conjuntos o colecciones de fragmentos de ADN (sondas) distintos fijados a una superficie sólida (vidrio, plástico o silicio).

17. ¿Qué es lo que detecta un microarray?

• Detecta simultáneamente miles de secuencias distintas, cualitativa y cuantitativamente.

18. Cómo son y cómo se marcan las sondas ancladas en los microarrays.

• Las sondas ancladas en biochip son monocatenarias y no están marcadas. Se marcan con fluorocromos la muestra qué se va a estudiar.

19. Pasos comunes que sigue cualquier protocolo genérico de microarrays.

• Marcaje de la muestra.
• Hibridación y lavados de post hibridación.
• Lectura de microarray.
• Análisis e interpretación de los resultados.

20. Cuáles son las estrategias a seguir a la hora de fabricarnos unos microarrays.

• Depositar las sondas, una a una, en posiciones determinadas del soporte sólido, como sondas se utilizan fragmentos de ADNc, oligonucleótidos sintéticos o productos de amplificación por PCR, con un único primer.
• Sintetizar la sonda sobre la propia superficie sólida, en este caso las sondas son pequeños oligonucleótidos.

21. Cita las dos aplicaciones más importantes de los microarrays.

• Hibridación genómica comparada en arrays (aCGH).
• Estudios de expresión génica (En términos absolutos, o en términos comparativos).

22. Explica brevemente la hibridación genómica comparada en arrays.

• La hibridación genómica comparada en arrays (aCGH) permite detectar e identificar alteraciones genéticas consistentes en pérdida (deleciones y microdeleciones) o ganancia (duplicaciones) de material genético, mediante la comparación del ADN de una muestra con un ADN de referencia.

23. ¿Cuál es la limitación principal de la hibridación genómica comparada?

• Su principal limitación es que no detecta alteraciones cromosómicas estructurales, cómo translocaciones o inversiones.

24. ¿Cuál es la aplicación más inmediata de la hibridación genómica comparada?

• Realizar estudios genómicos de células tumorales.

25. Explica brevemente los estudios de expresión génica en arrays.

• Permiten comparar la misma población celular en distintos estudios metabólicos o en distintas situaciones.

• En términos absolutos: Hibridando el microarray con el ADNc obtenido a partir del ARNm de una población celular.

• En términos comparativos: Hibridando el microarray con una mezcla del ADNc de la muestra problema y un ADNc de referencia, marcado con distintos fluorocromos.

26. ¿Qué se puede saber con los estudios de expresión génica en términos absolutos?

• Qué genes se expresan y con qué intensidad relativa en una población celular en un momento determinado y en unas condiciones concretas, y que genes están reprimidos.

27. ¿Qué se puede saber con los estudios de expresión génica en términos comparativos?

• Se pueden estudiar los efectos de los medicamentos y las respuestas frente a agentes físicos químicos o infecciosos.

28. ¿Para qué se utilizan los estudios de expresión comparada cuando comparamos metabolismos o poblaciones celulares en diferentes medios?

• Permiten comparar la misma población celular en distintos estadios metabólicos o en distintas situaciones, esto es muy útil para estudiar efectos de medicamentos y las respuestas ante agentes físicos, químicos o infecciosos.

29. Define en qué se basa la hibridación in situ fluorescente.

• Se marcan con fluorocromos las sondas y para visualizar los resultados es necesario un microscopio fluorescente.

30. Cita los cuatro pasos principales de una FISH genérica.

• Hibridación.
• Lavado de prehibridación.
• Contratinción.
• Visualización.

31. En qué consiste la FISH interfásica.

• Consiste en la detección de secuencias de ADN en núcleos en interfase, bien sobre preparaciones citogenéticas de núcleos desnudos, bien extensiones citológicas o secciones de tejido.

32. Qué son las sondas centroméricas.

• Son sondas qué hibridan con secuencias localizadas en el centrómero de cromosomas concretos.

33. Qué son y para qué sirven las sondas específicas de locus.

• Hibridan en regiones concretas de un cromosoma, implicadas en patologías específicas.

• Son útiles para detectar tanto anomalías numéricas como estructurales, siendo está su principal aplicación. En concreto, son muy útiles para identificar translocaciones, microdeleciones y microamplificaciones.

34. Define la FISH metafásica. ¿Para qué sirve?

• Consiste en la detección de secuencias de ADN directamente en los cromosomas sobre extensiones citogenéticas de metafase.

35. Qué nos permite la FISH multicolor.

• Permite la identificación diferencial de regiones subcromosómicas.

36. Define la ISH cromogénica. ¿Por qué se usa en ciertas muestras?

• Se caracteriza porque el híbrido se detecta mediante una reacción inmunohistoquímica qué produce un producto coloreado visible con un microscopio convencional de luz transmitida.

• Porque las muestras que se han fijado en formol adquieren cierto nivel de autofluorescencia, por lo que en muchos casos la interpretación de una técnica FISH sobre este tipo de muestras es muy problemática.