Técnicas de Hibridación en Biología Molecular

Técnicas de hibridación en soporte sólido

Se caracterizan porque una de las dos moléculas implicadas, la secuencia diana o una sonda, se inmovilizan sobre un soporte sólido previo a la hibridación.

Técnicas de Hibridación en medio líquido

El híbrido, son la secuencia diana, se forman en solución normalmente en pocillos de una placa microtiter y posteriormente se fija a la pared del pocillo para proceder a su detección.

Técnicas de hibridación in situ

Son las técnicas en las que la hibridación de los ácidos nucleicos se realiza directamente sobre extensiones citológicas o secciones de tejido y el resultado obtenido se analiza microscópicamente en el contexto de detalles morfológicos.

Hibridación in situ fluorescente (FISH)

Las sondas se marcan con fluorocromo y se requiere un microscopio de fluorescencia para visualizar los resultados.

Hibridación in situ cromogénica

La sonda se marca con haptenos, los híbridos se detectan por métodos inmunohistoquímicos produciendo al final una reacción coloreada que se visualiza con un microscopio óptico normal.

Dot blot

Es una técnica de hibridación simple que utiliza membranas de nitrocelulosa o nailon como soporte sólido y que permite detectar secuencias de ácidos nucleicos ADN o ARN en una mezcla compleja sin aportar ninguna información adicional.

ASO dot blot

Es una estrategia basada en dot blot para detectar mutaciones tanto en homocigosis como en heterocigosis mediante el empleo de oligonucleótidos específicos alelo.

Dot blot reverse

En esta técnica, lo que se inmoviliza en la membrana son distintos oligonucleótidos específicos de alelo, lo que permite estudiar genes con un gran número de variantes alélicas que afectan a distintas zonas del gen.

Hibridación de colonias

Es un tipo especial de dot blot utilizado para detectar bacterias que puedan tener una secuencia génica concreta, normalmente un gen de interés, un plásmido natural o un plásmido recombinante.

Hibridación de placas virales

Es un tipo de dot blot en el que se detectan virus que portan la secuencia diana, es especialmente útil en tecnología de ADN recombinante para localizar los fagos recombinantes que contienen la secuencia clonada, lo que se replica en la membrana del dot blot es la distribución de las placas virales del lisis producidas por los fagos sobre un césped de bacterias crecidas en una placa de cultivo.

Southern blot

Es una técnica de hibridación que permite identificar fragmentos de ADN separados por electroforesis en gel y transferidos a una membrana de nitrocelulosa o un nailon. Tiene las fases de digestión enzimática, electroforesis en gel, transferencia a membrana, hibridación y revelado.

Transferencia a una membrana

Tiene estos pasos: desnaturalización, transferencia y anclaje del ADN a la membrana.

Aplicación del Southern blot

La elaboración de huellas genéticas, el estudio de mutaciones estructurales, la detección de secuencias adquiridas.

Northern blot

Es una técnica de hibridación que permite detectar moléculas de ADN separadas por electroforesis en gel y transferidas a una membrana de nitrocelulosa o nailon.

Características del Northern blot

No se requiere digestión enzimática previa con enzimas de restricción, la electroforesis se realiza en condiciones desnaturalizantes, no es necesario el paso de desnaturalización antes de la transferencia del gel a la membrana.

Aplicación del Northern blot

El análisis de expresión génica, detección de mutaciones, estudios de corte y empalme o splicing alternativos.

Microarrays de ADN

Son conjuntos o colecciones de fragmentos de ADN (sondas) distintos fijados a una superficie sólida. Detectan simultáneamente miles de secuencias distintas cualitativa y cuantitativamente.

Hibridación con microarrays

Los pasos son marcaje de la muestra, hibridación y lavado de poshibridación, lectura del microarrays, análisis e interpretación de los resultados.

Aplicación de los microarrays

En hibridación genómica comparada y los estudios de expresión génica.

Hibridación genómica comparada en arrays (aCGH)

Permite detectar e identificar alteraciones genéticas consistentes en pérdidas (deleciones y microdeleciones) y ganancias (duplicaciones y microduplicaciones) de material genético mediante una comparación del ADN de una muestra con ADN de referencia.

Expresión génica en términos absolutos

Híbrida el microarrays con el ADN obtenido a partir del ARNm de una población celular.

Expresión génica en términos comparativos

Híbrida el microarrays con una mezcla de la ADNc de la muestra problema y un ADNc de referencia marcados con distintos fluorocromos.

Técnica de captura de híbridos

Se basa en la formación de híbridos a ARN ADN que serán reconocidos o capturados por anticuerpos específicos. Los pasos son lisis de los virus y desnaturalización del ADN, hibridación, captura del híbrido, detección del híbrido y revelado.

Tecnología del ADN ramificado

Consiste en un sistema de amplificación de señal basado en la unión de la secuencia diana a un macrocomplejo de ADN de tipo arborescente mediante sucesivas hibridaciones. Los pasos son lisis de las partículas víricas y desnaturalización, hibridación con sondas específicas, captura del híbrido, preamplificación, amplificación, detección y revelado.

Preparación de nucleótidos interfásicos desnudos

Los pasos son choque hipotónico, fijación, extensión de los núcleos.

Hibridación in situ fluorescente (FISH)

Se basa en el empleo de sondas marcadas con fluorocromos que son detectados visualizando las preparaciones con un microscopio de fluorescencia con los filtros adecuados. Los pasos son hibridación, lavado post hibridación, contratinción y visualización.

Técnicas de FISH interfásica

Consiste en la detección de secuencias de ADN en núcleos en interfase bien sobre preparación citogenética de núcleos desnudos o bien en extensiones citológicas o secciones de tejido.

Sondas centroméricas o sondas CEP

Hibridan con secuencias localizadas en el centromero de cromosomas concretos.

Sondas específicas de locus

Hibridan en regiones (locus) concretas de un cromosoma implicadas en patologías específicas.

Técnica de FISH metafásica

Consiste en la detección de secuencias de ADN directamente en los cromosomas sobre extensiones citogenéticas de metafase.

ISH cromogénica (CISH)

Se caracteriza porque el híbrido se detecta mediante una reacción inmunohistoquímica que produce un producto coloreado visible con un microscopio óptico convencional de luz transmitida.

Aplicación del CISH

Detección de secuencias génicas de virus oncológicos, detección del ARNm de las cadenas κ y α de las inmunoglobulinas para estudiar la clonalidad de infiltrados linfocitarios, estudios de expresión génica mediante la detección de ADN concretos.

Los pasos del CISH

Desparafinado y rehidratación, digestión enzimática, prehibridación, hibridación, lavado de poshibridación, detección de híbrido, contratinción y visualización.

Control positivo de la técnica (CIHS)

Sirve para comprobar que todos los reactivos funcionan correctamente, se realiza hibridando una muestra conocida que contiene la secuencia diana.

Control positivo de la muestra

Sirve para comprobar que el tejido ha sido tratado adecuadamente y que ha fijado correctamente, de manera que el tejido conserva sus ácidos nucleicos aptos para hibridación. Se realiza ELISA con sondas específicas de secuencias repetidas ALU para ADN y sondas poli-T para ARN.

Control negativo de la técnica (CISH)

Sirve para comprobar que ningún reactivo empleado tiñe de manera inespecífica algún componente del tejido del mismo color que el marcaje empleado. Se realiza exactamente igual que la reacción problema, eliminando la sonda de la solución de hibridación.

Control negativo de la muestra

Sirve para comprobar que el resultado observado es específico y no obedece a uniones inespecíficas de la sonda a diversas estructuras del tejido. Este control se realiza sustituyendo la sonda específica por secuencias no complementarias con los ácidos nucleicos de la muestra.