Técnicas de Dilución Seriada y Fundamentos de Espectrofotometría

1. Diluciones Seriadas (Banco de Diluciones)

¿Qué es una dilución seriada?

Una dilución seriada es una sucesión de diluciones realizadas a partir de una disolución madre, en la cual el factor de dilución se mantiene constante en cada uno de los pasos.

Concepto clave: Cada tubo sucesivo presenta una concentración menor que el anterior, manteniendo siempre la misma proporción o razón de dilución.

Fórmulas fundamentales

• Dilución (D):
  D = Vi / Vf = 1 / F

Donde los parámetros son:

• Vi: Volumen inicial.
• Vf: Volumen final.
• F: Factor de dilución.

Volúmenes clave en el proceso

• Vi (Volumen inicial): Es el volumen que se transfiere de un tubo a otro (también denominado Vp o volumen de paso).
• Vd (Volumen de diluyente): Se calcula mediante la fórmula:
  Vd = Vf - Vi

Procedimiento paso a paso (Esencial para examen)

1. Preparación: Se disponen varios tubos de ensayo.
2. Adición de diluyente: Se añade el mismo volumen de diluyente (Vd) a todos los tubos.
3. Transferencia inicial: Se toma el volumen de paso (Vp) de la disolución madre y se transfiere al tubo 1.
4. Homogeneización: Se mezcla bien el contenido del tubo.
5. Transferencia seriada: Se toma el mismo volumen (Vp) del tubo 1 y se transfiere al tubo 2.
6. Repetición: Se repite el proceso sistemáticamente en todos los tubos de la serie.

Resultado: Se obtiene una gradación donde cada tubo tiene una concentración decreciente respecto al anterior.

Cálculo de la concentración

Para determinar la concentración en cada tubo (n):
Cn = Cinicial × D
(La concentración se va multiplicando por el factor de dilución en cada paso sucesivo).

Aplicaciones prácticas

Este método es ampliamente utilizado en disciplinas como:

• Inmunología
• Hematología
• Microbiología
• Bioquímica

Ejemplos de uso:

• Determinación de concentraciones en suero u orina mediante espectrofotometría.
• Titulación de anticuerpos.
• Cuantificación de unidades formadoras de colonias (bacterias).
• Determinación de parámetros farmacológicos:
  • CMI: Concentración Mínima Inhibidora.
  • CMB: Concentración Mínima Bactericida.

2. Espectrofotometría

¿Qué es un espectrofotómetro?

Es un instrumento de precisión diseñado para medir:

• La cantidad de luz absorbida por una muestra.
• La cantidad de luz transmitida a través de una disolución.

Concepto clave: Radiación electromagnética

La luz es una forma de energía que se desplaza mediante ondas.

• Se cuantifica a través de la longitud de onda (λ).
• Su unidad de medida es el nanómetro (nm) (1 nm = 10⁻⁹ m).

El Espectro Electromagnético

Comprende diversas formas de radiación, entre las que destacan:

• Rayos gamma y Rayos X.
• Radiación Ultravioleta.
• Luz visible.
• Infrarrojo, Microondas y ondas de Radio.

La Luz Visible

• Abarca el rango de 400 a 700 nm.
• Es la fracción del espectro que el ojo humano percibe como colores.

Fisiología del color: ¿Por qué vemos colores?

La percepción cromática ocurre porque:

• La retina posee fotorreceptores denominados conos y bastones.
• Estos detectan distintas longitudes de onda que el cerebro interpreta como colores.

Principio óptico: Una sustancia presenta un color determinado porque absorbe ciertas longitudes de onda y refleja otras (el color percibido es el reflejado).

3. Transmitancia y Absorbancia

Transmitancia (%T)

Representa la fracción de luz que logra atravesar la muestra.
T = I / I₀

• I₀: Intensidad de la luz inicial.
• I: Intensidad de la luz transmitida.

Absorbancia (A)

Representa la cantidad de luz que es retenida o absorbida por la muestra.
A = log(100 / %T)

4. Bases de la Fotometría

Principio fundamental

Cuando un haz de luz atraviesa una sustancia:

• Inicia con el 100% de su energía.
• Una fracción es absorbida por las moléculas de la muestra.
• El resto se transmite y sale de la cubeta.

Factores que influyen en la absorción

1. Concentración: A mayor concentración de soluto, mayor es la absorción de luz.
2. Longitud del recorrido (Cubeta): Cuanto más larga es la cubeta (paso óptico), mayor es la absorción.
3. Longitud de onda: Cada sustancia posee un espectro de absorción específico, absorbiendo con mayor eficacia ciertos colores o longitudes de onda.

Idea clave: La luz absorbida es directamente dependiente de la concentración y del espesor de la muestra analizada.

5. Ley de Beer-Lambert

Es la ley fundamental que rige la fotometría cuantitativa:
A = ε · c · l

Donde:

• A: Absorbancia (unidad adimensional).
• ε (épsilon): Absortividad molar (constante específica de cada sustancia).
• c: Concentración de la solución.
• l: Longitud de la cubeta (paso óptico, generalmente 1 cm).

Interpretación técnica

La absorbancia es directamente proporcional a:

• La concentración del analito.
• El camino óptico que recorre la luz.

Resumen de proporcionalidad

• Si aumenta la concentración (↑), aumenta la absorbancia (↑).
• Si aumenta el grosor de la muestra (↑), aumenta la absorbancia (↑).