Técnicas de Diagnóstico Molecular y Biotecnología Genética

1. PCR/OLA (Oligonucleotide Ligation Assay)

Técnica dirigida para identificar qué base está mutada en un gen concreto. Para determinar si el genotipo es silvestre o mutante, se amplifica el fragmento por PCR (ejemplo: T es silvestre y G es mutado). Se diseña un oligonucleótido (OLA) complementario a la cadena, asociado con el marcador biotina, y otro oligo asociado al marcador desoxigenina complementario al resto de la cadena. Cuando se obtienen las copias del genoma amplificado por PCR, se añade el exceso de oligo y una ligasa que unirá ambos si están apareados (paciente silvestre). Se desnaturaliza el ADN y se añade a un pocillo de plástico recubierto con estreptavidina, que se asocia con la biotina, la cual estará unida al oligo de desoxigenina. Se añade un anticuerpo antidesoxigenina acoplado a la enzima fosfatasa alcalina y un sustrato incoloro que convierte la fosfatasa en un sustrato coloreado (indicando que el gen es silvestre). Si no hay ligación, el anticuerpo no se podrá unir y no habrá cambio de color.

2. Promotor de la Lactosa (Lac)

El promotor interactúa con el sistema de expresión génico y posee una alta afinidad con la ARN polimerasa, provocando que una región se transcriba. En este caso, interactúa con proteínas reguladoras que controlan la transcripción de genes adyacentes clonados:

• Ausencia de lactosa: El promotor Lac es reprimido por la unión de un represor, evitando la transcripción.
• Inducción: Se activa añadiendo al medio lactosa o IPTG.
• Regulación CAP: Para una mayor traducción, el promotor Lac es regulado por la proteína CAP, que se une a la caja CAP del ADN. Se activa cuando hay niveles altos de AMPc (presentes cuando la concentración de glucosa es baja).

Resumen: Poca glucosa, alta lactosa.

3. Ratón Knockout (KO)

Se obtienen células madre embrionarias de la cara interna del blastocisto. Se introduce el transgén donde se sustituye parte del ADN genómico por ADN externo, buscando la eliminación selectiva del gen de interés. Se seleccionan los recombinantes y se introducen en el blastocisto, el cual se implanta en una ratona adoptiva, dando lugar a un organismo quimérico con tejidos del blastocisto original y tejidos modificados.

4. Sondas con Candado

Técnica para identificar el sitio exacto de una mutación. Al ADN dentro de un pocillo de plástico se le añade una sonda con un marcador que hibrida con el ADN. Luego, se añade una ligasa que ligará si está perfectamente apareado. Después, se lava la muestra para eliminar las bases no ligadas. Así, se verifica si la muestra porta el marcador de la sonda y su relación con la secuencia.

5. Test Citogenéticos

Permiten identificar mutaciones de gran tamaño mediante el análisis de los cromosomas. La técnica FISH utiliza una sonda marcada que hibrida con la muestra, revelando lugares con alteraciones. Permite identificar, por ejemplo, el síndrome de DiGeorge (daño en el cromosoma 22).

6. Test Genéticos

Basados en el ácido nucleico como herramienta, detectan variantes en un gen que conducen a la ausencia o funcionamiento anómalo de una proteína. Ejemplo: Fenilcetonuria. Si falta la enzima Phe hidroxilasa, la fenilalanina no pasa a tirosina y se acumula debido a una mutación en un gen autosómico recesivo. Se emplea el test de Guthrie, que detecta niveles elevados de Phe en sangre mediante la capacidad de esta para facilitar el crecimiento bacteriano en un medio con inhibidor. Se realiza mediante punción en el talón del bebé a los pocos días de nacer.

7. Utilidad de los Test Genéticos

• Ventajas: Cantidad mínima de muestra, elevada especificidad analítica, alta sensibilidad (al obtener mayor cantidad de ADN/ARN por PCR), rapidez frente a métodos clásicos y, a veces, es la única técnica posible.
• Desventajas: Requiere conocimiento especializado, técnicas complejas, verificación de la utilidad de dianas, equipamiento sofisticado y necesidad de áreas físicamente separadas.

8. Vehículos de Transferencia

Son los encargados de asegurar la estabilidad del material genético transportado y vencer barreras biológicas para alcanzar el núcleo de la célula diana. Las barreras incluyen: estabilidad del medio extracelular, reconocimiento de la diana, unión a membrana, internalización y escape de sistemas de degradación (como lisosomas).