Tecnicas de siembra

en  muchas ocasiones, no se dispone d muestras lo sufi100temente puras o con la cantidad d mo requerida para poder realizar un estudio analítico con garantías. en estos casos es necesario cultivar dicha muestra, utilizando una técnica y 1s medios adecua2 según los objetivos q se pretendan conseguir.la obtención d un cultivo normalmente consta d varias fases:obtención d la muestra.transporte, conservación y preparación d la misma.siembra.incubación.se obtienen así colonias, q son agrupaciones d descendientes d un único mo.el mo q origina una colonia se denomina unidad formadora d colonia (u.f.c.).se llama inoculación al acto d agregar una cantidad d material (llamado inóculo), q presuntamente contiene mo, a un medio d cultivo.tras la inoculación suele hacerse un reparto o distribución del inóculo x el medio d cultivo, q puede ser:d modo homogéneo (como en los méto2 d recuento).d modo heterogéneo (como en el aislamiento mediante agotamiento del asa).

o no hacerse (como en la inyección d mo en animales d laboratorio).llamamos siembra a la inoculación + el reparto del inóculo; cuando no hacemos reparto, la siembra se reduce solo a la inoculación.el paso d mo d un cultivo a un medio d cultivo fresco se denomina resiembra. lo q se obtiene será un subcultivo.la resiembra es útil para el aislamiento (obtención d cultivos puros) y para mantener los mo con plena vitalidad el tiempo necesario.tras la siembra se realiza la incubación, q consiste en mantener el cultivo en unas condiciones adecuadas durante el tiempo necesario para su crecimiento.técnica general d preparación d inóculos: se toma con un asa estéril varias colonias d un cultivo joven y puro o d una porción d la muestra, y se suspende un una solución diluyente y se homogeneiza. se pueden utilizar como diluyentes: caldo d cultivo, el mismo medio base con el q se va a realizar la técnica pero sin agar; solución salina estéril, q es el + adecuado, formada x nacl (9 g) y agua destilada (milml); y tb agua destilada estéril.

2.- material y utensilios emplea2 en la realización d siembras

existe una gran variedad d material y utensilios para la siembra, alg1s se utilizan con gran frecuencia y otros se usan solo ocasionalmente. los + importantes son:

asa d siembra: es un hilo d platino o nicron, d 5 ó 6 cm d longitud sujeto x un extremo a un mango y formando en el otro una circunferencia d 2 a 3 mm d diámetro. sirve para transportar el inóculo d un medio a otro (se esterilizan inmediatamente antes y después d su uso, calentándolas al rojo vivo y se dejan enfriar antes d usarlas). existen tb asas d un solo uso.

asa calibrada: tb d platino o nicron  = a la anterior pero el volumen d líquido q es capaz d recoger está estandarizado. el aro tiene un diámetro determinado q corresponde a un volumen concreto; las + usadas son las d 0,01 y 0,001 ml.

hilo d platino o nicron: similar al asa pero sin la circunferencia en el extremo. utilizado para siembras en profundidad (picadura).

pipetas: se utilizan para inocular cantidades relativamente grandes. se esterilizan x calor seco o en autoclave. se disponen en paquetes para su esterilización. pueden utilizarse pipetas pasteur, q no miden volúmenes fijos y llevan un chupete incorporado, o pipetas graduadas, q permiten el paso d volúmenes determina2. se manejarán con la punta dirigida hacia abajo, manteniéndola vertical u oblicua y obturando la boquilla con el dedo índice o usando prepipeta.

asa d lewis o drigalsky:  son varillas d vidrio en forma d ele o triangular q se emplean para repartir uniformemente sobre una placa con medio d cultivo sólido un inóculo líquido.

hisopo: se emplean para la toma d muestras, con las cuales se prepara una suspensión, y para la homogeneización d muestras en placa. se compran estériles y son desechables.

placas d petri: recipientes d forma circular con tapa usa2 para siembras d mo. se compran estériles y deben manipularse semiabiertas y con la abertura orientada hacia la llama del mechero.

recipientes d vidrio: matraces, botellas o  tubos. cuando contengan algún producto en su interior, deben estar tapa2 con algodón graso o con un tapón. se manipularán del siguiente modo:

• no se abrirán en posición vertical, se realizará oblicuamente, dirigiendo la apertura hacia la llama.
• el tapón o algodón se coge con el dedo meñique d la mano opuesta q sostiene el recipiente, evitando todo contacto mientras se manipule el contenido el mismo.
• la boca se flameará después d retirar el cierre y antes d volver a ponerlo, para lo cual se expone a la llama 1s segun2 mediante un movimiento d rotación.

además se usan:

mechero: imprescindibles para el trabajo aséptico, crea un campo estéril y se requieren para flamear asas e hilos, bocas d material d vidrio, etc. pueden ser d gas o alcohol.

campana d flujo laminar: es un habitáculo con presión negativa (aspiración) q extrae cualquier partícula contaminante d su interior. en la parte superior se encuentran una serie d filtros esterilizantes y otros q eliminan olores desagradables. además, puede crear un campo estéril, con luz uv.

baños y estufas: los 1ºs termostatiza2, sirven para incubar, refundir medios d cultivo y mantener la temperatura; las estufas se utilizan para incubar los medios sembra2.

autoclave: para esterilizar mediante calor húmedo, siendo ideal para medios d cultivo y otros productos q puedan alterarse a altas temperaturas. tb se utiliza  para esterilizar material y para refundir medios d cultivo a vapor fluente.

3.- méto2 d siembra

existen distintas técnicas para sembrar en un medio (sólido, líquido) en función del soporte del medio (tubo o placa) y en función del objetivo q se quiera conseguir (recuento, aislamiento para identificación, …..).

3.1. técnicas d siembra en medios sóli2

3.1.1.  en placa

3.1.1.a) siembra en profundidad o homogeneización en masa

la finalidad principal es el recuento d mo.

se coloca 1 ml d la muestra en una placa estéril vacía, en el centro d la misma. sobre ella se agregan 20-25 ml d medio d cultivo fundido y termostatizado a 45ºc; luego se agita la placa, moviéndola 5 veces en sentido horario, 5 en sentido antihorario, 5 veces d arriba hacia abajo y 5 veces d derecha a izquierda.

la técnica d barry, indica q se ha d inocular el medio d cultivo fundido, homogeneizar y después verter en la placa d petri.

3.1.1.b) siembra en superficie o extensión en superficie

la finalidad principal es el recuento d mo.

se colocan 0.1 ml d la dilución d la muestra con pipeta estéril en el centro d la placa con medio d cultivo, y se distribuye con un asa d vidrio acodada (asa d y estéril

3.1.1.c) siembra x agotamiento del asa o aislamiento x agotamiento

la finalidad principal es el aislamiento d mo, aunque tb puede ser el recuento, si se emplean asas calibradas o bien se adiciona un volumen conocido mediante pipeta y posteriormente se reparte con el asa.

se trata d un método rápido y simple d agotamiento progresivo y continuo del inoculo sobre un medio sólido contenido en una placa d petri. el objetivo es obtener, a partir d un elevado número d mo, un número reducido d ellos distribui2 individualmente sobre la superficie d la placa. al incubar ésta, cada 1 d los mo originará una colonia.

recomendaciones previas: debe colocarse la placa en posición invertida sobre la mesa d trabajo y, tomando la parte q contiene el medio d cultivo, levantarla hasta la altura d la llama del mechero. allí, con ella en posición casi vertical, se realizarán las sucesivas tandas d estrías. para realizar las estrías oscile el asa d siembra sobre la superficie del agar mediante un balanceo sucesivo y rápido d la muñeca. no haga + presión sobre el agar q la debida al propio peso del asa y su mango. es muy importante emplear un asa d siembra en buen estado, pues una rota o deteriorada rasgará el agar.

• siembra en estría o en zig-zag
•  se deposita el inóculo en el extremo superior d la placa.
• se siembra con el asa, a partir del inóculo, con un movimiento en zig-zag cada vez + amplio (en la línea media d la placa alcanza su máxima amplitud). para ello, el asa debe contactar suavemente con la superficie del medio, no se debe realizar una presión excesiva, pues se agrietaría.
• la siembra se efectúa (sin levantar el asa ni flamearla) hasta la zona distal del comienzo, donde se obtendrán colonias aisladas.

• siembra en estría múltiple
• se deposita el inóculo en un extremo d la placa.
• con el asa se reparte en varios tramos, siguiendo el borde d la placa. entre cada tramo se debe flamear el asa.
• los segmentos segui2 describen un poliedro regular, el último tramo se efectúa hacia el interior, en el q se obtendrán las colonias aisladas.
• técnica d los 4 cuadrantes
• se divide la placa en 4 cuadrantes
• se deposita el inóculo en el extremo superior d 1 d los cuadrantes (1) y se siembra en estría.
• sin flamear el asa, se realiza la misma operación sucesivamente en los otros 3 cuadrantes (2, 3 y 4). en cada 1 d ellos se sembrará el inóculo q queda adherido al asa, tras la siembra del anterior.
• en el último d los cuadrantes sembrado (4), se encuentran las colonias aisladas.

• técnica d los 3 giros
• se siembra en estría la mitad d la placa
• flamear el asa
• se gira la placa 90º, sembrando en estría la mitad superior d la misma
• se repite la operación en los puntos 2 y 3.

las colonias aisladas aparecerán en la zona sembrada en último lugar.

3.1.2.  en tubos

3.1.2.a) siembra en profundidad o homogeneización en masa

= q lo visto en placa pero en tubo.

3.1.2.b) picadura o profundidad

en tubos con agar horizontal se siembran introdu100do una punta en el centro del agar.

1. se toma la muestra con la punta del hilo.
2. se punzona en el centro del medio (contenido en un tubo), introducién2e la punta del hilo hasta 2-3 mm del fondo del tubo.
3. se extrae el hilo x la misma línea q se introdujo.

3.1.2.c) superficie inclinada

en los tubos con agar inclinado, para sembrarlos, se mueve el asa o la punta suavemente sobre la superficie del agar con un movimiento en zigzag desde el fondo hasta la parte superior, cuidando d no dañar el agar. se suele utilizar para obtener masa d microorganismos, renovar cepas (resiembra) y pruebas bioquímicas.

3.1.2.d) superficie y profundidad

en los tubos con agar inclinado, se siembran:

1. se toma la muestra con la punta del hilo.
2. se punzona en el extremo inferior del medio (contenido en un tubo), introducién2e la punta del hilo hasta 2-3 mm del fondo del tubo.
3. se extrae el hilo x la misma línea q se introdujo.
4. cuando estamos con el hilo sobre la superficie del medio sólido, se mueve la punta suavemente sobre la superficie del agar con un movimiento en zigzag desde el fondo hasta la parte superior, cuidando d no dañar el agar. se suele utilizar para obtener masa d microorganismos, renovar cepas (resiembra) y pruebas bioquímicas.

técnica d aislamiento x dilución

consiste en realizar diluciones sucesivas d la muestra en condiciones d esterilidad con objeto d sembrar después cantidades conocidas d las mismas en placas d petri. sirve para obtener colonias aisladas d microorganismos y tb para evaluar el número d gérmenes viables en la muestra original. evidentemente, alguna d las diluciones será tal q al distribuir una parte d ella en la placa originará colonias separadas.

d = manera, conoci2 el número d colonias, la cantidad sembrada y la dilución correspondiente, esta técnica permite evaluar el número d gérmenes viables en la muestra original.

se emplean tanto el método d siembra en profundidad como el d siembra en superficie. la siembra en profundidad se realiza tal como se describió anteriormente. tb se pueden preparar las diluciones directamente en tubos d agar fundido y termostatizado (20 ml) se agita x rotación entre las manos y se vierte en placas d petri estériles.

se recomienda sembrar al - 2 placas x cada dilución. en la transferencia d las diluciones a las placas es posible emplear tan sólo una pipeta si se comienza x la dilución del factor d dilución + alto (la + diluida). en caso contrario habrá q emplear una pipeta para cada dilución.

si, x ejemplo, se van a sembrar x duplicado 3 diluciones, se dispone el medio d cultivo fundido y atemperado a 1s 45ºc en 6 tubos d ensayo. se inoculan los 2 1ºs tubos a partir d la muestra original (con pipeta o asa), se homogeneizan y se marcan como 1. a partir d ellos se inoculan los 2 tubos marca2 con  el número 2; se homogeneiza y a partir d ellos se inoculan los tubos marca2 con el número 3. a continuación, se homogeneizan los tubos y se vierte su contenido en las correspondientes placas marcadas como 1, 2 y 3. en las placas marcadas con el número 3 se obtendrán las colonias aisladas.

3.2. técnicas d siembra en medios líqui2

habitualmente se realiza en tubos o en matraces. el crecimiento se puede manifestar x enturbiamiento, x formación d velo o película, o x sedimento.

• con asa: se sumerge el asa cargada en el medio y se agita, para ello se emplea el vortex.
• con pipeta: se vierte el contenido d la pipeta sobre el medio d cultivo y sehomogeneiza.
• con hisopo o escobillón: se realiza d = modo q con el asa.
• con jeringa: se emplea para inocular en frascos herméticos o a través d tapones d caucho.

3.3. siembra d anaerobios

la siembra d anaerobios estrictos puede realizarse en unas condiciones u otras dependiendo d su tolerancia al oxígeno.

hay bacterias anaerobias extremadamente sensibles al oxígeno molecular y mueren rápidamente x exposición al mismo. estas deben ser sembradas en las cámaras anaeróbicas (uso corriente en laboratorio d hospitales); q tb suelen emplearse como cámara d cultivo.

si el mo anaerobio tiene una resistencia algo mayor al o₂ se puede realizar una siembra normal, aunque la incubación sea siempre en condiciones anaerobias (p.e. clostridium y la mayoría d los anaerobios patógenos).

4. conservación d cultivos

los cultivos pueden conservarse sin q los mo pierdan su viabilidad.

los méto2 d conservación dependen del tipo d mo y del tiempo q debe mantenerse viable.

- cultivos en agar inclinado:

• se conservan en zonas oscuras a tª ambiente o nevera.
• resiembras a intervalos entre 1 mes y 2 años (según la especie).

- cultivos anaerobios:

• se mantienen en medios q proporcionan condiciones reductoras.
• resiembras cada año.

- cultivos en tubo:

• se cubren x completo con parafina líquida estéril.
• conservan su viabilidad durante varios años sin hacer resiembras.

- cultivos liofiliza2:

• el cultivo se congela y deseca mediante alto vacío, se almacena en ampollas d vidrio q se cierran al vacío y se guardan a tª ambiente o nevera.
• permanecen viables varios años.

- método del cultivo continuo:

• consiste en añadir d forma continua al cultivo, en medio líquido, nutrientes.
• simultáneamente se extrae un volumen similar d cultivo.