Técnicas de cultivo microbiológico: siembra, inoculación e incubación

Fases del Cultivo Microbiológico

La obtención de un cultivo generalmente consta de varias fases:

• Obtención de la muestra.
• Transporte, conservación y preparación de la misma.
• Siembra.
• Incubación.

Se obtienen así colonias, que son agrupaciones de descendientes de un único microorganismo. El microorganismo que origina una colonia se denomina unidad formadora de colonia (UFC). Se llama inoculación al acto de agregar una cantidad de material (llamado inóculo), que presuntamente contiene microorganismos, a un medio de cultivo. Tras la inoculación suele hacerse un reparto o distribución del inóculo por el medio de cultivo, que puede ser: de modo homogéneo (como en los métodos de recuento), de modo heterogéneo (como en el aislamiento mediante agotamiento del asa), o no hacerse (como en la inyección de microorganismos en animales de laboratorio). Llamamos siembra a la inoculación más el reparto del inóculo; cuando no hacemos reparto, la siembra se reduce solo a la inoculación. El paso de microorganismos de un cultivo a un medio de cultivo fresco se denomina resiembra. Lo que se obtiene será un subcultivo. La resiembra es útil para el aislamiento (obtención de cultivos puros) y para mantener los microorganismos con plena vitalidad el tiempo necesario. Tras la siembra se realiza la incubación, que consiste en mantener el cultivo en unas condiciones adecuadas durante el tiempo necesario para su crecimiento.

Técnica General de Preparación de Inóculos

Se toma con un asa estéril varias colonias de un cultivo joven y puro o de una porción de la muestra, y se suspende en una solución diluyente y se homogeniza. Se pueden utilizar como diluyentes: caldo de cultivo, el mismo medio base con el que se va a realizar la técnica pero sin agar; solución salina estéril, que es la más adecuada, formada por NaCl (9 g) y agua destilada (1000 ml); y también agua destilada estéril.

Tipos de Siembra y Materiales

Tipos de Siembra según la Muestra y el Medio

Material y Utensilios Empleados en la Realización de Siembra

Existe una gran variedad de material y utensilios para la siembra. Los más importantes son:

• Asa de siembra: Es un hilo de platino o nicrom, de 5 o 6 cm de longitud sujeto por un extremo a un mango y formando en el otro una circunferencia de 2 a 3 mm de diámetro. Sirve para transportar el inóculo de un medio a otro (se esterilizan inmediatamente antes y después de su uso, calentándolas al rojo vivo y se dejan enfriar antes de usarlas). Existen también asas de un solo uso.
• Asa calibrada: También de platino o nicrom, igual a la anterior pero el volumen de líquido que es capaz de recoger está estandarizado. El aro tiene un diámetro determinado que corresponde a un volumen concreto; las más usadas son las de 0,01 y 0,001 ml.
• Hilo de platino o nicrom: Similar al asa pero sin la circunferencia en el extremo. Utilizado para siembras en profundidad (picadura).
• Pipetas: Se utilizan para inocular cantidades relativamente grandes. Se esterilizan por calor seco o en autoclave. Se disponen en paquetes para su esterilización. Pueden utilizarse pipetas Pasteur, que no miden volúmenes fijos y llevan un chupete incorporado, o pipetas graduadas, que permiten el paso de volúmenes determinados. Se manejarán con la punta dirigida hacia abajo, manteniéndola vertical u oblicua y obturando la boquilla con el dedo índice o usando prepipeta.
• Asa de Lewis o Drigalsky: Son varillas de vidrio en forma de L o triangular que se emplean para repartir uniformemente sobre una placa con medio de cultivo sólido un inóculo líquido.
• Hisopo: Se emplean para la toma de muestras, con las cuales se prepara una suspensión, y para la homogenización de muestras en placa. Se compran estériles y son desechables.
• Placas de Petri: Recipientes de forma circular con tapa usados para siembras de microorganismos. Se compran estériles y deben manipularse semiabiertas y con la abertura orientada hacia la llama del mechero.
• Recipientes de vidrio: Matraces, botellas o tubos. Cuando contengan algún producto en su interior, deben estar tapados con algodón graso o con un tapón. Se manipularán del siguiente modo: no se abrirán en posición vertical, se realizará oblicuamente, dirigiendo la apertura hacia la llama. El tapón o algodón se coge con el dedo meñique de la mano opuesta que sostiene el recipiente, evitando todo contacto mientras se manipule el contenido del mismo. La boca se flameará después de retirar el cierre y antes de volver a ponerlo, para lo cual se expone a la llama unos segundos mediante un movimiento de rotación.

Equipos Adicionales

• Mechero: Imprescindibles para el trabajo aséptico, crea un campo estéril y se requieren para flamear asas e hilos, bocas de material de vidrio, etc. Pueden ser de gas o alcohol.
• Campana de flujo laminar: Es un habitáculo con presión negativa (aspiración) que extrae cualquier partícula contaminante de su interior. En la parte superior se encuentran una serie de filtros esterilizantes y otros que eliminan olores desagradables. Además, puede crear un campo estéril, con luz UV.
• Baños y estufas: Los primeros termostatizados, sirven para incubar, refundir medios de cultivo y mantener la temperatura; las estufas se utilizan para incubar los medios sembrados.
• Autoclave: Para esterilizar mediante calor húmedo, siendo ideal para medios de cultivo y otros productos que puedan alterarse a altas temperaturas. También se utiliza para esterilizar material y para refundir medios de cultivo a vapor fluente.