Técnicas de Biología Molecular: PCR, Secuenciación de ADN y Aplicaciones
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Amplificación de ADN por PCR
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es un método alternativo a la clonación molecular, que permite obtener un gran número de fragmentos de ADN a partir de una sola copia de ADN. La amplificación del ADN por PCR se lleva a cabo completamente in vitro. En esta técnica, la ADN polimerasa se emplea para replicar repetidamente un segmento determinado de ADN.
El fragmento inicial puede ser ADN clonado o una mezcla de moléculas de ADN. Los cebadores son oligonucleótidos sintetizados químicamente. En cada ciclo se obtienen dos moléculas de ADN nuevas a partir de la original. Los fragmentos de ADN se duplican con cada ciclo de replicación.
El PCR se aplica en el diagnóstico de enfermedades hereditarias.
Aplicaciones de la Secuenciación de ADN
- Detección de mutaciones: previamente descritas. Una vez que se ha caracterizado la relación con una enfermedad de una determinada mutación puntual (cáncer).
- Diagnóstico prenatal/Diagnóstico preimplantación: diagnóstico de enfermedades hereditarias o determinación del sexo del feto previamente a su implantación en procesos de fecundación in vitro.
- Proyecto Genoma Humano: el objetivo final es obtener una descripción completa del genoma humano a través de la secuenciación del ADN.
Cuantificación y Fusión del ADN
10. La cuantificación de los ácidos nucleicos se determina a través de la técnica de espectrofotometría: mide la cantidad de luz de una longitud de onda específica que es absorbida por una solución de ácido nucleico.
Fusión del ADN: Consiste en la separación de la doble hebra de ADN en sus dos cadenas componentes por acción desnaturalizante del calor, por lo que también se denomina desnaturalización térmica. La temperatura correspondiente a la mitad de la máxima absorbancia se denomina temperatura de fusión (Tf). A mayor contenido de G-C del ADN, mayor será la Tf. Mayor Tº, para romper sus enlaces.
Terapia Génica
11. En la actualidad la terapia génica se utiliza para el tratamiento de enfermedades unigénicas, cáncer, diabetes mellitus, patologías del tejido hematopoyético, entre otras.
Limitaciones de la Terapia Génica
- La mayoría de vectores deja los nuevos genes extracromosómicos, por lo que el efecto se pierde rápidamente por digestión del ADN o porque en las mitosis sucesivas el nuevo material no se incorpora a los cromosomas.
- La limitación principal es el corto tiempo de expresión de la proteína nueva.
- Los métodos más utilizados como vectores son el retrovirus, los liposomas y los adenovirus.
Vectores para el ADN Recombinante
Se requiere que en el ADN plasmidial exista un origen de replicación, una secuencia de ADN que señala el inicio de replicación a la ADN polimerasa de la célula huésped.
- Cósmidos: Es un plásmido que contiene sitios cos (coadhesivos), que permiten empaquetar su ADN en partículas de fago λ. [Se ligan fragmentos de ADN a un sitio de clonación para obtener el tamaño aproximado al fago λ]. Tienen origen de replicación y genes de resistencia a antibióticos, son capaces de replicarse como plásmidos en bacterias.
- Cromosomas artificiales: Son segmentos de ADN que contienen todos los elementos necesarios para propagar un cromosoma en levadura. [Transportan grandes cantidades de material genético]. [Pueden introducirse en células de Saccharomyces cerevisiae y replicarse junto con los cromosomas verdaderos].
Clonación Molecular y Método de Sanger
8. La clonación molecular de un gen permite el aislamiento de grandes cantidades de este gen y su posterior análisis, incluyendo la determinación de la secuencia de nucleótidos.
El conocimiento de la secuencia nucleotídica ha permitido estudiar los productos génicos (proteínas) y las propiedades de las secuencias de ADN que regulan la expresión génica.
Actualmente es más fácil clonar y secuenciar ADN que determinar la secuencia de aminoácidos de una proteína.
Método de Sanger
- Los 4 desoxirribonucleótidos trifosfatos (dATP, dGTP, dTTP y dCTP).
- El análogo didesoxi de uno de los nucleótidos (competirá con su homólogo (dATP, etc.) por incorporarse a la cadena de ADN).
- La incorporación de un didesoxinucleótido detiene la síntesis de ADN, porque no hay grupo 3´ al que añadir otro nucleótido.
- Estos fragmentos se separan por electroforesis según su tamaño. Se detectan por exposición del gel a una película radiográfica (autorradiografía).
- La secuenciación a gran escala se realiza con sistemas automáticos, utilizando cebadores fluorescentes.
Esta técnica ha permitido secuenciar genomas completos de bacterias, levaduras, C. elegans, Drosophila y humanos.