Técnica PCR: definición, aplicaciones y ventajas

1. Define la técnica PCR.

Es una técnica in vitro de amplificación de ADN que permite obtener millones de copias iguales de un fragmento concreto de ADN, partiendo de una cantidad mínima de ADN molde.

2. Qué conseguimos mediante la técnica PCR.

• Amplificar varios fragmentos distintos en una única reacción (PCR múltiple).
• Amplificar fragmentos de ARN (RT-PCR).
• Cuantificar la concentración de una molécula concreta de ácido nucleico presente en una muestra.

3. Comenta las ventajas de las técnicas PCR respecto a otras técnicas

• Como técnica de amplificación, suponen un considerable ahorro de tiempo y además están completamente automatizadas.
• Como técnica de detección, requiere una cantidad de muestra muchísimo menor (respecto a la hibridación), además permite la cuantificación de secuencias concretas.

4. Ventajas y problemas de la PCR.

Su principal ventaja es su gran sensibilidad, pero también puede presentar problemas de contaminación por aerosoles, microorganismos y células de descamación.

5. Cuáles son las aplicaciones más inmediatas de la PCR.

• El diagnóstico y pronóstico de ciertas enfermedades.
• La evolución y respuesta a tratamientos.
• Los estudios de expresión génica.
• Mutagénesis.
• Estudios filogenéticos.
• Genotipado.
• Medicina forense, etc.

6. ¿Qué son los cebadores? ¿Cuántos tipos hay?

Son oligonucleótidos monocatenarios cuya secuencia es complementaria de las regiones que flanquean el fragmento que se quiere amplificar. Hay dos tipos: cebador forward (se une a la hebra molde con dirección 3'-5') y cebador reverse (se une a la hebra molde con dirección 5'-3').

7. ¿Cuál es la función de los cebadores?

Define y delimita la región diana de una molécula de ADN que se amplificará y que será la comprendida entre ambos.

8. En el diseño de los cebadores, ¿cuál es la longitud idónea? ¿y la proporción idónea del contenido G-C?

La longitud idónea es la comprendida entre 18 y 30 bases. La proporción idónea está comprendida entre un valor del 40% y el 60% de contenido de G-C.

9. Qué no deben contener en su secuencia los cebadores.

Los cebadores no deben contener secuencias complementarias intra- e intermoleculares.

10. Define las ADN polimerasas termoestables.

Son enzimas aisladas de un grupo especial de arqueobacterias extremófilas (termófilas) con actividad polimerasa a temperaturas elevadas.

11. Citar los diferentes tipos de ADN polimerasas termoestables.

Existen tres tipos: con actividad exonucleasa 5'-3' pero sin actividad exonucleasa 3'-5', con actividad exonucleasa 5'-3' y actividad exonucleasa 3'-5', y con actividad transcriptasa inversa.

12. De qué tres fases consta un ciclo básico de PCR.

• Desnaturalización del ADN molde.
• Hibridación de los cebadores con el ADN molde.
• Extensión de los cebadores.

13. Cuáles son los productos de amplificación de la PCR, del primer ciclo, del segundo y del tercero.

Productos del primer ciclo: 2 productos no deseados y 0 productos deseados. Productos del segundo ciclo: 4 productos no deseados y 0 productos deseados. Productos del tercer ciclo: 6 productos no deseados y 2 amplicones.

14. Qué es un PCR estándar o convencional. Define.

Es la forma más simple de PCR, en la que se amplifica un único fragmento de ADN, con un único par de cebadores y en un único proceso de amplificación a tiempo final.

15. Qué es la mezcla de reacción. Define.

Es la mezcla que contiene todos los reactivos necesarios que deben estar presentes en el medio de reacción para que la PCR se desencadene de forma adecuada.

16. Cuál es la función del cloruro magnésico.

En concentración baja, determina la inactividad de la ADN polimerasa. En concentración alta, determina una menor fidelidad en la replicación.

17. Qué requisitos o criterios de calidad son necesarios del ADN molde para PCR.

El ADN molde debe tener un alto grado de integridad, ser de alto peso molecular, no estar degradado ni fragmentado y sin mellas. Además, el cociente A260/A280 debe estar entre 1,7 y 2 para garantizar que no está contaminado con proteínas. También debe estar libre de contaminantes que puedan inhibir la reacción de PCR.

18. Qué es la mezcla master.

Es la mezcla de todos los componentes necesarios para la realización de la PCR, como cloruro magnésico, dNTPs, cebadores y la ADN polimerasa. El ADN molde no se añade a esta mezcla.

19. Qué es un control positivo, y un control negativo o blanco.

El control positivo es un tubo con mezcla master que se añade ADN molde control que contiene el fragmento que se quiere amplificar. El control negativo o blanco es un tubo con mezcla master en el que se sustituye el ADN molde por agua, de manera que no habrá ADN presente en la reacción.

20. Qué es un termociclador y qué permite.

Es el aparato en el que se lleva a cabo la reacción de la PCR. Permite programar los ciclos repetitivos con varias temperaturas y tiempos de incubación para que se desarrollen de forma automatizada.

21. En qué consiste la programación de un termociclador.

Se programa la temperatura y los tiempos de incubación de cada una de las fases del ciclo básico de PCR. También se establece el número de veces que se va a repetir el ciclo. Al finalizar, se realiza una extensión final y se puede mantener la muestra a 4°C.

31. Define la PCR tiempo real. Cómo se monitoriza? Qué ventajas tiene?. Qué la diferencia de la PCR a tiempo final.

La PCR a tiempo real es una técnica en la que se monitoriza el proceso de amplificación mediante el empleo de productos fluorescentes, de manera que la detección de los amplicones se realiza ciclo a ciclo. Esto permite una detección más rápida y fiable de secuencias diana en una muestra, minimizando los problemas de contaminación y permitiendo la cuantificación de los amplicones y del ADN diana inicial presente en la muestra. A diferencia de la PCR a tiempo final, en la PCR tiempo real se realiza la detección de los productos de amplificación durante la reacción, en lugar de al finalizarla.