Qué es un sistema genético represible

PCR:

A partir de pequeñas cantidades de una muestra inicial y su material genético, se puede amplificar múltiples copias de este que se encuentra en muy bajas cantidades en una muestra inicial. 

Reactivos principales del PCR:

-Primer: delimitan la regíón a copiar.

-ADN polimerasa:

• Taq: soporta muy altas temperaturas, pero presenta mayor número de errores, realiza entre 30-40 ciclos de PCR sin tener que abrir el tubo para agregar más enzima.

• Pfu: presenta mayor estabilidad y proofreading (corrección), es más lenta en polimerizar y no adiciona A

-Nucleótidos libres

Análisis de productos de PCR:

Se usa electroforesis en el gel de agarosa para visualizar los fragmentos amplificados, permite confirmar el tamaño y presencia del producto esperado.

Etapas del PCR:

Desnaturalización (95°):

el calor rompe los puentes de hidrógeno entre las dos hebras de ADN, separándolas en cadenas simples. Su objetivo es dejar expuestas las secuencias para que los primers puedan unirse.

Alineamiento (50-65°):

los primers se unen por complementariedad a las regiones específicas del ADN molde. Su objetivo es marcar el inicio y el final del fragmento que se quiere amplificar. La temperatura debe ser lo suficientemente baja para permitir la uníón, pero lo bastante alta para evitar uniones inespecíficas.

Elongación (72°):

la ADN polimerasa añade nucleótidos libres al extremo 3’ del primer, sintetizando una nueva hebra complementaria. Su objetivo es duplicar el fragmento de ADN.

Aplicaciones de PCR:

Diagnóstico clínico, monitoreo y evaluación de terapia, detección de cepas resistentes a antibióticos, detección de mutaciones puntuales, polimorfismo genético y medicina forense.

RT-PCR:

es una técnica que primero convierte ARNm en ADN complementario mediante la enzima transcriptasa inversa. Luego, ese ADNc se amplifica con el ciclo clásico de PCR.

Etapas del RT-PCR:

Conversión de ARN a ADNc: se parte de una muestra rica en ARN, se usan primers, el oligo(dt) se une a la cola poli-A de los ARNm eucariontes, los primers aleatorios permiten copiar cualquier regíón y los primers específicos diseñados para un gen concreto. La transcriptasa inversa sintetiza la primera hebra de ADNc. El ARN original se degrada y se completa la segunda hebra → ADNc de doble cadena. Después se produce la amplificación de ADNc con PCR. 

Real time PCR:

Permite monitorizar la amplificación del ADN en cada ciclo de la reacción, en lugar de esperar al final para analizar los productos. Se logra gracias a los flúoróforos que emiten señal cuando se unen al ADN o cuando se liberan durante la síntesis

Ventajas del Real Time PCR:

Alta sensibilidad, alta especificidad y rapidez, detección a partir de cualquier muestra biológica, no es necesario que la muestra sea estéril, la detección de un patógeno en particular aún en presencia de otros patógenos y permite analizar la cinética de la reacción→ ver como aumenta el ADN en cada ciclo.

Diferencias entre PCR standard real y PCR tiempo:

El PCR standar real, analiza el punto final (el producto), y la detección del producto es por electroforesis en gel; mientras que el PCR tiempo presenta un análisis de la cinética de la reacción y presenta detección del producto en cada ciclo de la reacción. 

TaqMan:

Es una técnica de detección basada en sondas fluorescentes específicas, cada sonda TaqMan está diseñada para un fragmento concreto de ADN. Esta sonda lleva Flúoróforo que emite luz y el Quencher que apaga la fluorescencia mientras están juntos. 

Mecanismo TaqMan:

En el sistema TaqMan, primero se diseña una sonda específica que se coloca entre los primers y se une a la secuencia objetivo del ADN; esta sonda lleva un flúoróforo y un quencher, de modo que mientras están juntos la fluorescencia permanece apagada. Durante el ciclo de PCR, los primers se alinean y la polimerasa comienza a extender la cadena, encontrando la sonda unida al molde. Gracias a su actividad exonucleasa 5’→3’, la polimerasa degrada la sonda TaqMan mientras avanza, liberando el flúoróforo del quencher. Al separarse, el flúoróforo emite fluorescencia, y esa señal es detectada en tiempo real por el termociclador. Así, cada vez que se degrada una sonda se libera luz, y la intensidad acumulada refleja directamente la cantidad de ADN amplificado, lo que permite una cuantificación precisa y altamente específica del material genético inicial.