Selección e identificación de clones recombinantes en ingeniería genética

3. Selección e Identificación de Clones Recombinantes

Tras el proceso de introducción del ADN extraño en células hospedadoras, se obtienen 3 tipos de células:

• Células no transferibles: No han captado ninguna molécula de ADN extraño.
• Células transferibles que portan el vector recombinante específico: Contienen el ADN extraño insertado en el vector.
• Células transferibles que portan un vector no recombinante: Contienen vectores que no han integrado el ADN extraño (moléculas no deseadas-ligación).

Es necesario un proceso de selección para eliminar las células no transferibles y de identificación para reconocer los clones recombinantes que portan el vector con el ADN de interés. Este proceso puede realizarse simultáneamente utilizando marcadores genéticos presentes en el vector.

Genes de Resistencia a Antibióticos

Esta técnica se basa en el empleo de vectores que contienen dos genes de resistencia a antibióticos, comúnmente ampicilina y tetraciclina. El punto de inserción del ADN extraño se encuentra dentro de la secuencia de uno de los genes de resistencia, por ejemplo, el gen de resistencia a tetraciclina. En los vectores recombinantes, este gen no es funcional porque su secuencia está interrumpida por el inserto de ADN extraño.

Cuando se introduce este vector en bacterias sensibles a ambos antibióticos, se obtienen 3 tipos de células:

• Células no transferibles: Sensibles a ampicilina y tetraciclina.
• Células transferibles con el vector recombinante: Resistentes a la ampicilina, pero no a la tetraciclina.
• Células transferibles con un vector no recombinante: Resistentes a ambas, ampicilina y tetraciclina.

En un medio de cultivo sólido con ampicilina, solo crecerán las bacterias que hayan incorporado el vector (recombinante o no). La identificación se realiza replicando esta placa en otra con tetraciclina, donde solo crecerán las bacterias con el vector no recombinante (resistentes a ambos antibióticos). Los clones recombinantes serán aquellos que crezcan en la placa con ampicilina pero no en la de tetraciclina.

Estrategia Cromosómica

Esta estrategia se utiliza cuando se combinan:

• Bacterias hospedadoras deficientes en lactosa (lac-): No producen la enzima β-galactosidasa y son sensibles al antibiótico para el que el vector porta resistencia (por ejemplo, ampicilina).
• Vectores que contienen un gen de resistencia al antibiótico y el gen LacZ (β-galactosidasa) con un sitio de clonaje múltiple (MCS) en su interior: En los vectores recombinantes, el gen LacZ no es funcional porque su secuencia se interrumpe por el inserto de ADN extraño.

La selección y la identificación se realizan simultáneamente. Cuando se introduce el vector en la bacteria sensible al antibiótico, se obtienen:

• Células no transferibles: Sensibles al antibiótico y lac-.
• Células transferibles con el vector recombinante: Resistentes al antibiótico y lac-.
• Células transferibles con el vector no recombinante: Resistentes al antibiótico y lac+.

Se utiliza un medio de cultivo sólido con el antibiótico, un inductor del operón lac (como IPTG) y un sustrato cromogénico (como X-gal). En este medio, solo crecen las bacterias que portan el vector (recombinante o no). Las bacterias con el vector recombinante (lac-) producen colonias blancas, mientras que las bacterias con el vector no recombinante (lac+) producen colonias azules.

Operón lac

El gen LacZ codifica la β-galactosidasa y forma parte del operón lac, responsable del transporte y metabolismo de la lactosa en E. coli. Este operón consta de tres genes que codifican enzimas, un promotor y un represor. Las cepas que tienen un operón lac funcional (lac+) pueden utilizar lactosa como fuente de carbono. Las cepas que no tienen funcional el operón lac son lac-.

La funcionalidad del operón lac se puede detectar in vitro utilizando medios de cultivo que contienen un inductor (IPTG) y un sustrato cromogénico (X-gal).

Proteínas Fluorescentes

Esta técnica se basa en el empleo de vectores con un gen de resistencia a un antibiótico para la selección y un gen que codifica una proteína fluorescente, como la GFP (Green Fluorescent Protein), para la identificación. El sitio de clonaje múltiple (MCS) se incluye dentro del gen de la proteína fluorescente, de manera que la inserción del ADN extraño inactiva el gen.

La selección de bacterias que han incorporado el vector se realiza por crecimiento en medios de cultivo sólidos con el antibiótico. La identificación se realiza iluminando las placas de cultivo con luz UV: las bacterias con plásmidos no recombinantes mostrarán fluorescencia, mientras que las bacterias con plásmidos recombinantes no la mostrarán.

Genes Letales

Esta estrategia utiliza vectores con un gen de resistencia a un antibiótico (marcador de selección) y un gen que codifica para una proteína letal para las bacterias (marcador de identificación) con un sitio de clonaje múltiple (MCS) en su interior. En los vectores recombinantes, la proteína letal no es funcional porque la secuencia genética queda interrumpida por el inserto de ADN extraño.

La selección e identificación se realizan cultivando las bacterias en un medio con el antibiótico. En este medio, únicamente se desarrollan las bacterias que porten el vector recombinante. Las bacterias no transferibles no crecen porque son sensibles al antibiótico, y las bacterias con el vector no recombinante mueren por efecto de la proteína letal.

4. Tasa de Transformación

La tasa de transformación mide la eficiencia de la introducción del vector en la célula hospedadora. Se puede calcular utilizando la siguiente fórmula:

Tasa de transformación = (Número de colonias transformadas / Cantidad de ADN utilizado) x Volumen de transformación

Cuando se realizan estrategias cromogénicas, se puede calcular la tasa de transformación recombinante sustituyendo en la expresión matemática el número de colonias crecidas en la placa con antibiótico por el número de colonias blancas (bacterias con el vector recombinante).

También se puede calcular el porcentaje de células transformadas recombinantes respecto del total y, si se siembra una placa control sin antibiótico, se puede calcular el porcentaje de células transformadas respecto a las totales.

specto a las totales.