Recompte i identificació microbiològica: tècniques i criteris

Tècniques de recompte: directe

Microscòpia: Cambra de recompte: S'utilitza per a microorganismes en suspensió líquida mitjançant una quadrícula de volum conegut (cambra de Neubauer o Thoma). Frotis tenyit: Extensió d'un volum conegut en una superfície determinada; es compta per camp microscòpic. Avantatges: Molt ràpid; permet observar la morfologia. Inconvenients: No distingeix entre cèl·lules vives i mortes; no és útil per a densitats microbianes molt baixes.

Comptador de partícules

Mètode: Automàtic, utilitzant comptadors electrònics com el comptador Coulter o làser (citometria de flux). Funcionament: Mesura el canvi de resistència elèctrica quan les partícules passen per un orifici estret (cada vegada que passa una partícula es registra un impuls). Avantatges: Fàcil i ràpid. Inconvenients: Només és útil amb partícules de major grandària (llevats, protozous o algues). Requereix microorganismes unicel·lulars. Compta viables i inviables.

Dilucions seriades (tubs i plaques)

Si es parteix d'un aliment sòlid, cal realitzar la dilució mare. Es pesen entre 10 i 25 g i es multiplica per 9 per a calcular el volum de medi (aigua peptònica) a afegir. Després s'homogeneïtza amb stomacher. Avantatges: Compta només cèl·lules vives (capaces de formar colònia). Inconvenients: Mètode lent per la incubació.

En tub (Dilució) (NMP): Preparació de la mostra en base 10 (1/10, 1/100, etc.) quan la càrrega és massa elevada. Càlcul: Es calcula el nombre més probable (NMP) de bacteris a partir dels tubs positius (tèrbols) per dilució en els quals apareix creixement i amb l'ajuda de taules de probabilitat generades per al mètode.

En placa (Sembra): Sembra de les dilucions en medi sòlid (superfície o massa). Càlcul: Es busquen plaques d'entre 30 i 300 colònies per a un recompte significatiu (plaques de 90 mm).

Filtració per membrana

Per a mostres amb molt baixa densitat (ex.: aigües potables). Mètode: Filtració de gran volum a través d'una membrana (porus 0,45 µm, nitrocel·lulosa); els microorganismes es queden en la superfície. La membrana es diposita sobre el medi i s'incuba per comptar les colònies. Equips variats: Des de kitasato amb embut fins a rampa de filtració amb 3 o més embuts. Els filtres es col·loquen sobre plaques de 55 mm i poden comptar-se de 15 a 150 colònies.

Tècniques de recompte: indirecte

Factor important a l'hora d'elegir la tècnica: el temps. En la indústria, interessa conèixer immediatament l'evolució del creixement del cultiu microbià.

Recompte indirecte: pes sec

Mètode: Molt aproximat. Determinació de la biomassa total filtrant a través d'una membrana que reté les cèl·lules i assecant la mostra en estufa fins a pes constant. Inconvenient: No diferencia entre cèl·lules vives o mortes.

Recompte indirecte: turbidimetria

Concepte: Tècnica que permet determinar la quantitat de llum que és dispersada en travessar una dissolució; s'utilitza el nefelòmetre o espectrofotòmetre. Relació: La turbidesa és directament proporcional a la massa de partícules o cèl·lules en suspensió. Abast: Les cèl·lules que dispersen la llum són tant les viables com les no viables. Procediment: Cal fer prèviament una corba de calibratge per a cada microorganisme. Aquesta corba relaciona l'absorbància (densitat òptica) amb les UFC estimades o amb la concentració (µg de cèl·lules / ml).

Recompte indirecte: mesura del trifosfat d'adenosina (ATP)

Mètode: La luciferasa de la cuqueta de llum (Photinus pyralis) emet llum en presència d'ATP i oxigen. Aquesta llum es mesura amb un equip especial (bioluminòmetre). Funció: Permet determinar l'augment de la concentració d'ATP i relacionar-ho amb el nombre de cèl·lules. Abast: Només permet recomptes de cèl·lules vives. Actualitat: Existeixen equips portàtils que realitzen el recompte in situ.

Recompte indirecte: PCR (qPCR)

Importància: Tècnica avançada i cada vegada més comuna en laboratoris microbiològics. Característiques: Enormement sensible, eficient i molt ràpida. Concepte: La reacció en cadena de la polimerasa és una reacció enzimàtica in vitro que multiplica milions de vegades una seqüència específica d'ADN. Funció: Permet identificar i quantificar el microorganisme realitzant els calibratges adequats.

Tècniques d'identificació i criteris

Tècniques d'identificació: criteris morfològics: S'aplica en els primers moments de qualsevol identificació després d'un aïllament. Característiques macroscòpiques: Estudi de les colònies (forma, mida, color, vora, elevació, aspecte). Característiques microscòpiques: Observació directa al microscopi de la cèl·lula i les seves estructures. Característiques tintorials: Resposta a diferents tintures (Gram, Ziehl-Neelsen, etc.).

Mètodes i criteris bioquímics: Canvis de color: deguts a l'aparició d'àcids detectables amb un indicador (microorganismes que fermenten sucres). Aparició de gas: detectables fàcilment amb campanes de Durham. Altres: hidròlisi de proteïnes, hemòlisi, producció d'àcid sulfhídric (H₂S), etc.

Identificació: macrotècniques: S'utilitza un medi de cultiu de composició complexa per fer diverses proves alhora. Agar-ferro-Kligler (AKI): el més utilitzat. Detecta l'ús de sucres, producció de gas i de H₂S.

Microtècniques: Sistemes preparats que permeten realitzar una bateria de 10 a 20 proves alhora, reduint cost i temps (de 4 a 24 h).

Sistemes ràpids: Tires reactives: tires de paper impregnades amb reactius que detecten enzims específics o metabolits finals mitjançant una reacció ràpida. Permeten identificar la majoria d'enterobacteris seguint les instruccions del fabricant.

Tipificació de fagos

Tipificació de fagos: La interacció entre un virus bacterià (fago) i la seva cèl·lula bacteriana sensible és sumament específica, ja que el procés d'absorció es troba modificat per receptors específics tant en el virus com en la cèl·lula bacteriana. A una placa amb medi de cultiu sòlid inoculat amb un cultiu pur d'un determinat bacteri, se li afegeix una alíquota d'un fago específic. El fago pot ocasionar la lisi (destrucció) dels bacteris, fet que s'evidencia en el cultiu amb zones clares definides (plaques d'lisi) que indiquen que hi va haver

Assaigs serològics

• Basats en la reacció específica antigen-anticòs. Tècniques: aglutinació en làtex, ELISA (assajos d'immunoabsorció lligats a enzims) o immunofluorescència. Avantatge: Permeten una identificació molt ràpida i específica.

Biologia molecular (PCR)

• Consisteixen en la detecció i amplificació de seqüències d'ADN o ARN específiques. Com hem vist en el recompte, la PCR permet identificar el microorganisme sense necessitat d'arribar a obtenir cultius purs madurs.

Criteris microbiològics

1. Criteris de seguretat alimentària:
   • Són aplicables a productes comercialitzats.
   • Si no es compleixen, el producte s'ha de retirar del mercat.
   • Microorganismes que s'analitzen: Listeria monocytogenes, Salmonella, enterotoxines estafilocòcciques, Cronobacter spp., Escherichia coli, histamina.
2. Criteris d'higiene del procés:
   • Serveixen per verificar el correcte funcionament del procés de producció.
   • Microorganismes que s'analitzen: recompte de colònies aeròfiles (aerobis), família Enterobacteriaceae, Salmonella, Escherichia coli, estafilococs coagulasa positius, Bacillus cereus.