Cargas microbianas, esterilización e identificación microbiana: pruebas bioquímicas
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Resumen
El documento explica cómo se prepara y cuenta una muestra según su carga microbiana (alta, intermedia o baja), y describe el esterilizador Koch y la incubación de cultivos. Después repasa los métodos de identificación microbiana, desde la morfología y la tinción hasta las pruebas bioquímicas como la oxidasa, la catalasa y las pruebas IMViC. Es un material útil para prácticas de microbiología básica.
Puntos clave
- Con cargas microbianas altas se hacen diluciones decimales (10-1, 10-2...) porque sembrar directamente daría más de 300 colonias y el recuento no sería válido.
- Con cargas intermedias se siembra un volumen de 0,1-1 ml, se incuba y se dividen las UFC contadas entre el volumen sembrado.
- Con cargas bajas se filtran 50-100 ml de muestra con un filtro que retenga microorganismos y el filtro se coloca en una placa de cultivo.
- El esterilizador Koch genera vapor a 100 ºC y puede aplicarse en una exposición de 90 min o en calentamientos intermitentes de 30 min durante 3 días consecutivos.
- Las placas se incuban invertidas para que la humedad condensada no caiga sobre las colonias.
- La prueba de la oxidasa detecta la enzima citocromo oxidasa: color púrpura indica positivo; si tarda más de un minuto, es oxidasa retardada positiva.
- La prueba de la catalasa detecta la descomposición del agua oxigenada en agua y oxígeno gaseoso, que se observa como burbujeo.
- Las pruebas IMViC (indol, rojo de metilo, Voges Proskauer y citrato) sirven para identificar bacterias de la familia Enterobacteriaceae.
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Carga microbiana intermedia
Se procede a sembrar un volumen de muestra (0,1-1 ml) se incuba y se cuentan Las colonias.
Se cuentan las UFC y se dividen entre el volumen sembrado.
Carga microbiana alta
Se hacen diluciones decimales, porque si se siembra directamente la muestra se Encontrarán mas de 300 colonias y el recuento no sería válido.
Se comienza haciendo la primera dilución con 1 parte de muestra y 9 partes de Diluyente.
Según la cantidad de muestra, ésta primera dilución se hace en un tubo o en un Frasco.
A partir de la dilución preparada (10-1), se toma 1 ml de forma Estéril y se introduce en un tubo que contenga 9 ml de diluyente. Se Homogeneiza y se tiene una dilución (10-2).
Así se sigue hasta conseguir la dilución requerida, según la carga microbiana Que se espere.
Todo debe estar estéril.
Carga microbiana baja
Se toma un volumen grande de muestra (50-100 ml) y filtrarla utilizando un Filtro que retenga a los microorganismos. Este filtro se coloca en una placa de Cultivo y se incuba.
Esterilizador Koch de vapor: consiste en generar vapor a presión atmosférica (100ºC) y se va a emplear para aquellas sustancias que se pueden estropear con El calor del autoclave. Se puede utilizar de dos maneras:
·Una sola exposición de 90 min
·Calentamiento intermitente durante 3 Días consecutivos durante 30 minutos (mucho más eficaz).
La primera exposición destruye células vegetativas hasta la segunda que Germinan las endosporas y hay una tercera exposición para asegurar la Esterilización.
Incubación: es el proceso mediante el cual vamos a conseguir el crecimiento de Las bacterias una vez que se han sembrado en el medio adecuado, en estufas Microbiológicas. Siempre se meten las placas invertidas para evitar que la Humedad condensada caiga sobre las colonias estropeando el cultivo. Excepción: Cultivo de microorganismos que se reproducen por esporas (mohos).
IDENTIFICACIÓN MICROBIANA
1. Morfología microscópica:determinar la forma y la disposición de los Microorganismos mediante la utilización del microscopio.
2. Carácterísticas tintoriales: estudio de la interacción microorganismo-
Colorante (gram+gram-)
3. Morfología macroscópica:morfología de la colonia:
Tamaño, color, forma, Bordes, elevación 4. Pruebas de identificación bioquímica
Cada microorganismo tiene su propio metabolismo, regulado por enzimas que son Carácterísticas de esa bacteria.
Todas las pruebas que se hacen siempre tienen Que ser sobre un cultivo puro. Como resultado final: positivo/negativo
·Producción de ácido (se pone de manifiesto con un indicador que cambiara de Color si se producen dichos ácidos) y gas (se puede detectar tanto en medios Líquidos, mediante retención con campanas Durham, como en medios sólidos, por La formación de burbujas, desplazamiento incluso roturas de medio)
·Producción de ácido sulfhídrico: determinar si se ha liberado ácido Sulfhídrico H2S por acción enzimática sobre aminoácidos que Contienen azufre.
·Prueba de la oxidasa:
Finalidad es determinar la presencia de la enzima Citocromo oxidasa
Positiva/negativa. Para determinar esta enzima se usan indicadores que pueden Ser oxidados por dicha enzima. Estos indicadores son incoloros en su forma Reducida y obtienen color cuando se oxidan. Procedimiento: Se coge una placa de Petri vacía se coloca un trozo de papel de filtro, se añaden al papel 2 o 3 Gotas del reactivo oxidasa (indicador incoloro). Se toca con el asa de siembra La colonia y lo extiendo sobre el papel. Si la bacteria en contacto con el Reactivo es oxidasa positiva si aparece un color púrpura. Si el color tarda mas De un minuto en aparecer es oxidasa retardada positiva. Si no sale es oxidasa Negativa. Se hace tanto la prueba que es muy frecuente comercializar tiras, Discos o bastoncillos impregnados en el reactivo que hay que utilizar.
·Prueba de la catalasa:
La catalasa es una enzima que actúa sobre el agua oxigenada, produciendo agua Más oxígeno gaseoso. El procedimiento consiste en poner en contacto la bacteria Con el agua oxigenada, si se produce un burbujeo es que está apareciendo Oxígeno y por tanto esa bacteria es catalasa positiva.
·Pruebas IMViC:
Son 4 pruebas de identificación bioquímica que se utilizan a la vez y su Finalidad es la identificación de bacterias de la familia Enterobacteria.
-Prueba del indol: determina la capacidad que tiene el microorganismo de Producir indol a partir de triptófano (aminoácido). Si la bacteria produce Indol se pondrá de manifiesto su presencia con un determinado reactivo
-Prueba del rojo de metilo: esta prueba investiga la capacidad del microorganismo De producir ácidos cuando fermentan azucares
-Prueba de Voges Proskauer: Investiga la capacidad del microorganismo de Producir acetoína como producto intermedio del metabolismo de la glucosa. Mismo Medio que rojo de metilo
-Prueba del citrato: investiga la capacidad del microorganismo de utilizar Citrato como única fuente de carbono. Si es capaz el pH se vuelve básico. El Indicador cambia de color de verde(negativo) a azul(positivo).
Se procede a sembrar un volumen de muestra (0,1-1 ml) se incuba y se cuentan Las colonias.
Se cuentan las UFC y se dividen entre el volumen sembrado.
Carga microbiana alta
Se hacen diluciones decimales, porque si se siembra directamente la muestra se Encontrarán mas de 300 colonias y el recuento no sería válido.
Se comienza haciendo la primera dilución con 1 parte de muestra y 9 partes de Diluyente.
Según la cantidad de muestra, ésta primera dilución se hace en un tubo o en un Frasco.
A partir de la dilución preparada (10-1), se toma 1 ml de forma Estéril y se introduce en un tubo que contenga 9 ml de diluyente. Se Homogeneiza y se tiene una dilución (10-2).
Así se sigue hasta conseguir la dilución requerida, según la carga microbiana Que se espere.
Todo debe estar estéril.
Carga microbiana baja
Se toma un volumen grande de muestra (50-100 ml) y filtrarla utilizando un Filtro que retenga a los microorganismos. Este filtro se coloca en una placa de Cultivo y se incuba.
Esterilizador Koch de vapor: consiste en generar vapor a presión atmosférica (100ºC) y se va a emplear para aquellas sustancias que se pueden estropear con El calor del autoclave. Se puede utilizar de dos maneras:
·Una sola exposición de 90 min
·Calentamiento intermitente durante 3 Días consecutivos durante 30 minutos (mucho más eficaz).
La primera exposición destruye células vegetativas hasta la segunda que Germinan las endosporas y hay una tercera exposición para asegurar la Esterilización.
Incubación: es el proceso mediante el cual vamos a conseguir el crecimiento de Las bacterias una vez que se han sembrado en el medio adecuado, en estufas Microbiológicas. Siempre se meten las placas invertidas para evitar que la Humedad condensada caiga sobre las colonias estropeando el cultivo. Excepción: Cultivo de microorganismos que se reproducen por esporas (mohos).
IDENTIFICACIÓN MICROBIANA
1. Morfología microscópica:determinar la forma y la disposición de los Microorganismos mediante la utilización del microscopio.
2. Carácterísticas tintoriales: estudio de la interacción microorganismo-
Colorante (gram+gram-)
3. Morfología macroscópica:morfología de la colonia:
Tamaño, color, forma, Bordes, elevación 4. Pruebas de identificación bioquímica
Cada microorganismo tiene su propio metabolismo, regulado por enzimas que son Carácterísticas de esa bacteria.
Todas las pruebas que se hacen siempre tienen Que ser sobre un cultivo puro. Como resultado final: positivo/negativo
·Producción de ácido (se pone de manifiesto con un indicador que cambiara de Color si se producen dichos ácidos) y gas (se puede detectar tanto en medios Líquidos, mediante retención con campanas Durham, como en medios sólidos, por La formación de burbujas, desplazamiento incluso roturas de medio)
·Producción de ácido sulfhídrico: determinar si se ha liberado ácido Sulfhídrico H2S por acción enzimática sobre aminoácidos que Contienen azufre.
·Prueba de la oxidasa:
Finalidad es determinar la presencia de la enzima Citocromo oxidasa
Positiva/negativa. Para determinar esta enzima se usan indicadores que pueden Ser oxidados por dicha enzima. Estos indicadores son incoloros en su forma Reducida y obtienen color cuando se oxidan. Procedimiento: Se coge una placa de Petri vacía se coloca un trozo de papel de filtro, se añaden al papel 2 o 3 Gotas del reactivo oxidasa (indicador incoloro). Se toca con el asa de siembra La colonia y lo extiendo sobre el papel. Si la bacteria en contacto con el Reactivo es oxidasa positiva si aparece un color púrpura. Si el color tarda mas De un minuto en aparecer es oxidasa retardada positiva. Si no sale es oxidasa Negativa. Se hace tanto la prueba que es muy frecuente comercializar tiras, Discos o bastoncillos impregnados en el reactivo que hay que utilizar.
·Prueba de la catalasa:
La catalasa es una enzima que actúa sobre el agua oxigenada, produciendo agua Más oxígeno gaseoso. El procedimiento consiste en poner en contacto la bacteria Con el agua oxigenada, si se produce un burbujeo es que está apareciendo Oxígeno y por tanto esa bacteria es catalasa positiva.
·Pruebas IMViC:
Son 4 pruebas de identificación bioquímica que se utilizan a la vez y su Finalidad es la identificación de bacterias de la familia Enterobacteria.
-Prueba del indol: determina la capacidad que tiene el microorganismo de Producir indol a partir de triptófano (aminoácido). Si la bacteria produce Indol se pondrá de manifiesto su presencia con un determinado reactivo
-Prueba del rojo de metilo: esta prueba investiga la capacidad del microorganismo De producir ácidos cuando fermentan azucares
-Prueba de Voges Proskauer: Investiga la capacidad del microorganismo de Producir acetoína como producto intermedio del metabolismo de la glucosa. Mismo Medio que rojo de metilo
-Prueba del citrato: investiga la capacidad del microorganismo de utilizar Citrato como única fuente de carbono. Si es capaz el pH se vuelve básico. El Indicador cambia de color de verde(negativo) a azul(positivo).
·Sistemas multipruebas: Existen ya en el mercado varios
Sistemas comerciales que permiten realizar varias pruebas bioquímicas simultáneamente.
Preguntas frecuentes
¿Por qué se hacen diluciones decimales en las cargas microbianas altas?
Porque si se siembra la muestra directamente aparecerían más de 300 colonias y el recuento no sería válido. Las diluciones permiten contar un número manejable de colonias.
¿Por qué se incuban las placas invertidas?
Para evitar que la humedad condensada caiga sobre las colonias y estropee el cultivo. La excepción son los microorganismos que se reproducen por esporas, como los mohos.
¿Qué indica una prueba de oxidasa positiva?
Que la bacteria posee la enzima citocromo oxidasa, lo que se observa cuando el reactivo se torna de color púrpura al contacto con la colonia.
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